Choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera, Parkinsona czy Huntingtona, wraz z udarami i urazami mózgu stanowią jedno z wielkich wyzwań, przed jakimi stoi współczesna medycyna. Choroby te łączy jeden wspólny czynnik – postępująca utrata licznych, często ściśle określonych anatomicznie, populacji neuronów, prowadząca do stopniowej utraty przez chorego zdolności do normalnego funkcjonowania. Dostępne leczenie jest z reguły objawowe, pozwala ono w najlepszym przypadku na spowolnieniu rozwoju choroby, nie eliminuje jednak jej przyczyn, które zresztą są zazwyczaj trudne do określenia. Poza chorobą Huntingtona oraz dziedzicznymi odmianami chorób Alzheimera i Parkinsona, w większości przypadków można jedynie spekulować na temat czynników sprzyjających powstaniu choroby.

Alternatywą leczenia objawowego może być stworzenie terapii pozwalających zatrzymać utratę komórek nerwowych lub zastąpić te już utracone. Jednym ze sposobów osiągnięcia tego celu jest przeszczep neuronów. Podstawowa koncepcja jest prosta – jeśli bylibyśmy w stanie wprowadzić wyhodowane poza organizmem pacjenta neurony do odpowiedniej struktury i skłonić je do zastąpienia utraconych komórek, to utracone funkcje motoryczne czy kognitywne mogłyby zostać przywrócone. Potencjalne źródła przeszczepianych neuronów mogłyby być różne: od embrionalnych neuroblastów (niedojrzałych neuronów) i embrionalnych komórek macierzystych, przez komórki prekursorowe pobrane od pacjenta, np. ze szpiku, aż do tak zwanych indukowanych komórek pluripotentnych. Te ostatnie to komórki somatyczne, na przykład fibroblasty, w których wymuszona została ekspresja genów charakterystycznych dla komórek macierzystych. W efekcie stają się one zdolne do częstych podziałów oraz różnicowania się w rozmaite typy komórek potomnych. Niezależnie od pochodzenia, komórki prekursorowe namnaża się, różnicuje w kierunku neuronów za pomocą technik inżynierii komórkowej (np. poprzez hodowlę w obecności odpowiednich czynników wzrostu) i wprowadza do uszkodzonej struktury.

Pierwszą operację wszczepienia embrionalnej tkanki nerwowej przeprowadzono w szpitalu w Lund w 1989 roku u 49-letniego pacjenta z ciężkim przypadkiem choroby Parkinsona. Badacze mieli nadzieję, że przeszczepione komórki zastąpią zdegenerowane komórki ośrodka zwanego prążkowiem. Ten ośrodek zawiera komórki produkujące dopaminę, neuroprzekaźnik, którego brak bezpośrednio prowadzi do pojawienia się objawów choroby. Pierwsze wyniki były obiecujące: nastąpiła poprawa, polegająca na złagodzeniu objawów choroby i (wykrywalnym za pomocą pozytronowej tomografii emisyjnej) przywróceniu wydzielania dopaminy. Jednak po ponad dwóch dekadach tego typu eksperymentów nadal nie udało się wyeliminować problemów, takich jak niska i przemijająca skuteczność i skutki uboczne.

Jak zwykle w przypadku terapii eksperymentalnych, diabeł tkwi w szczegółach. Każda opcja pozyskiwania komórek prekursorowych niesie ze sobą określone ryzyko i problemy: od kwestii etycznych, związanych z pozyskiwaniem komórek macierzystych z ludzkich embrionów, po problem kompatybilności, na jaki natrafia każda terapia polegająca na transplantacji komórek między nieidentycznymi genetycznie osobnikami. Osobną, skomplikowaną kwestią jest też problem stabilności genetycznej używanych linii komórkowych (co sprowadza się do zachowania przez długi czas pożądanego profilu ekspresji genów). Wreszcie – problemy związane z „macierzystością” komórek używanych do pozyskiwania neuronów. Jeśli bowiem stosujemy procedurę polegającą na przeprowadzaniu komórek przez różne czynniki różnicujące w kierunku neuronów, ryzykujemy, że na poszczególnych etapach mniej niż 100 proc. komórek zróżnicuje się. Jeśli te komórki, zachowujące charakter prekursorowy, nie zostaną całkowicie usunięte z populacji komórek przeszczepianych, oprócz potencjalnej poprawy możemy zafundować biorcy nowotwór.

Wszystkie opisane powyżej problemy nie przekreślają jednak sensu leczenia chorób neurodegeneracyjnych za pomocą przeszczepów. Potencjalne korzyści z tego typu terapii sprawiają, że warto udoskonalać istniejące metody i poszukiwać nowych. Rozwiązanie, jak często bywa w biologii, może nadejść z niespodziewanej strony – być może czeka ono wewnątrz samego uszkodzonego mózgu.

Miliardy szarych eminencji

Ludzki mózg składa się z prawie dwustu miliardów komórek, jednak neurony, czyli komórki tworzące synapsy i generujące potencjały czynnościowe, są tylko jednym z jego składników. Co najmniej połowa wszystkich komórek mózgu to glej – kategoria, w skład której wchodzi kilka wyspecjalizowanych subpopulacji. Najbardziej interesującą w kontekście wytwarzania neuronów de novo jest najliczniejsza z nich: astrocyty. Opisane przez pierwszych neuroanatomów jako komórki podporowe, przez ostatnie dwie dekady dostarczyły neurobiologom wielu zaskoczeń. Astrocyty okazały się bowiem komórkami bardzo wyspecjalizowanymi i pełniącymi liczne, skomplikowane funkcje: nie tylko wspierają metabolizm neuronów, ale też współtworzą barierę krew-mózg, kształtują środowisko pozakomórkowe dzięki ekspresji licznych białek transporterowych, umożliwiających wychwyt neurotransmiterów i jonów, wreszcie – aktywnie uczestniczą w przekazywaniu informacji, odbierając bodźce od neuronów i wydzielając substancje sygnałowe. Ich rozmieszczenie w mózgu jest wysoce uporządkowane, przyjmuje postać tak zwanych domen astrocytarnych, ciasno upakowanych trójwymiarowych obszarów, w których pojedynczy astrocyt kontaktuje się – za pośrednictwem cienkich, filopodialnych wypustek – z synapsami neuronów, naczyniami krwionośnymi i innymi komórkami glejowymi. Każdy taki obszar jest „obsługiwany” wyłącznie przez pojedynczy astrocyt, a wypustki astrocytów sąsiednich nie penetrują do wnętrza domeny.

Tym bardziej zaskakujący jest fakt, że w trakcie rozwoju osobniczego prekursorowe komórki, od których pochodzi większość neuronów w mózgu, mają charakter astrocytarny: przypominają astrocyty morfologią i wykazują podobieństwa w ekspresji genów. W dorosłym mózgu jedynie kilka odizolowanych populacji komórek prekursorowych w strefie podziarnistej zakrętu zębatego hipokampa i w strefie podkomorowej zachowuje zdolność do tworzenia nowych neuronów. Te prekursory również posiadają astrocytarny charakter. Najbardziej uderzające jest jednak zachowanie astrocytów nie w normalnym, a właśnie w uszkodzonym mózgu. Stan zapalny, mechaniczny uraz, przerwanie ciągłości naczyń krwionośnych – powodują przejście astrocytów ze stanu spoczynkowego w formę reaktywną. Reaktywny astroglej, oprócz wielu innych zmian w morfologii i ekspresji genów, posiada również zdolność do podziałów mitotycznych, w wyniku których powstaje więcej astrocytów wypełniających miejsce uszkodzenia.

Astrocyty posiadają więc, z punktu widzenia naprawy i zastępowania straconych neuronów, aż trzy bardzo obiecujące właściwości: znajdują się, same z siebie i bez żadnych dodatkowych manipulacji, w miejscu uszkodzenia, zachowują zdolność do podziałów i w każdej chwili mogą przejść ze stanu spoczynkowego do proliferacji, wreszcie – przynajmniej potencjalnie komórki z tej linii mogą przekształcać się w neurony. Jak jednak można kontrolować te procesy?

Molekularny hacking

Ekipa Benedykta Berningera i Magdaleny Götz postanowiła znaleźć odpowiedź na pytanie, czy możliwe jest przeprogramowanie spoczynkowych astrocytów w neurony. W tym celu izolowali oni astrocyty z kory mózgowej kilkudniowych myszy (u których neurogeneza jest już zakończona i jednocześnie trwa rozwój i dojrzewanie synaps oraz astrocytów). Pozyskane w ten sposób astrocyty są zdolne do podziałów i mogą być hodowane w formie przyczepionej do podłoża lub w postaci tak zwanych neurosfer, czyli pływających kulistych zbitków składających się z dzielących się komórek. Rozróżnienie to jest o tyle istotne, że kontakt z podłożem jest sygnałem dla komórek, hamującym podziały i kierującym ich rozwój w stronę bardziej dojrzałej morfologii i ekspresji genów charakterystycznej dla spoczynkowej populacji. Brak takiego kontaktu hamuje różnicowanie się komórek, zatrzymując je w stadium prekursorowym. Jednak dzielące się poza organizmem astrocyty, niezależnie od tego, czy hodowane są w postaci rozpłaszczonej na podłożu, czy w formie pływającej neurosfery, same z siebie dają początek jedynie kolejnym astrocytom. Aby zbadać, czy możliwe jest przekształcenie ich w neurony, należy je przeprogramować, indukując w nich ekspresję genów, które wymuszą przyjęcie przez komórkę neuronalnego fenotypu. Robi się to w sposób analogiczny z włamywaniem się i modyfikacją programu komputerowego – za pomocą wirusa zawierającego kod wymuszający na „oprogramowaniu” komórki wykonanie instrukcji założonych przez autora tegoż wirusa.

W tym przypadku słowo „wirus” jest całkowicie dosłowne – transformujące geny dostarczane są do astrocytów za pomocą zmodyfikowanego retrowirusa, zawierającego geny, których ekspresja w normalnym mózgu jest związana z neurogenezą, oraz specjalne fluorescencyjne białko – DsRed, pozwalające śledzić zainfekowane komórki. Geny, które w ten sposób wprowadzono do astrocytów, to Neurog2, Dlx1 i Mash1. Są to tak zwane czynniki transkrypcyjne, czyli geny regulujące ekspresję wielu innych genów i w ten sposób kontrolujące liczne funkcje komórki jednocześnie. W trakcie rozwoju mózgu ulegają ekspresji w dwóch różnych strukturach i dają początek dwóm podstawowym rodzajom neuronów, różniących się wydzielanym neurotransmiterem. Neurog2 ulega ekspresji w grzbietowej części kresomózgowia i stymuluje różnicowanie się prekursorów w glutamatergiczne (czyli wydzielające glutaminian) neurony pobudzające. Z kolei komórki wykazujące ekspresję dwóch pozostałych czynników transkrypcyjnych znajdują się w kresomózgowiu brzusznym i dają początek hamującym neuronom wydzielającym GABA (kwas gamma-aminomasłowy). I takie też jest działanie tych genów in vitro – astrocyty, w których zostają one „włączone”, różnicują się w neurony odpowiedniego typu, wykazujące ekspresję neuronalnych białek markerowych, zdolność do tworzenia funkcjonalnych synaps, jak również właściwości elektrofizjologiczne charakterystyczne dla dojrzałych komórek nerwowych.

Co więcej, te same czynniki transkrypcyjne są w stanie przeprogramować w podobny sposób również astrocyty pochodzące z dorosłego mysiego mózgu. Jest to o tyle zaskakujące, że astrocyty wyizolowane z kory mózgowej starszego niż dwutygodniowe zwierzęcia nie są w normalnych warunkach zdolne do wydajnych podziałów i nie da się w prosty sposób hodować ich in vitro . Jednak procesy aktywacji astrocytów, z jakimi mamy do czynienia w uszkodzonym mózgu, mogą częściowo znieść tę barierę. Berninger i Götz zaobserwowali, że mechaniczne uszkodzenie kory wystarczyło, by reaktywne astrocyty odzyskały zdolność do tworzenia neurosfer w kulturze i były podatne na przeprogramowanie.

Kontekst przede wszystkim

Na przykładzie powyżej opisanego eksperymentu widać, jak ogromne znaczenie dla funkcjonowania astrocytów ma kontekst molekularny, w jakim te komórki się znajdują. W normalnym mózgu astrocyt odbiera od sąsiednich komórek (neuronów, śródbłonka naczyń, innych astrocytów) sygnały, które hamują jego podziały. Ten stan rzeczy nie jest jednak niezmienny – w uszkodzonym mózgu środowisko zmienia się na mniej „restrykcyjne”, bardziej podobne do środowiska w mózgu rozwijającym się. Efektem tego jest odhamowanie podziałów i odblokowanie zdolności astrocytów do różnicowania się w neurony w kulturze (choć nadal – nie w mózgu).

Implikacje tego są dość poważne i wykraczają daleko poza możliwość wykorzystania tych zjawisk w celach terapeutycznych. Jako neurobiologa interesuje mnie, jak astrocyty działają, na ile heterogenne są te komórki i jak przekłada się to na ich funkcje. W trakcie mojej pracy magisterskiej zadałem pytanie, czy wszystkie astrocyty w danej strukturze są takie same? By na nie odpowiedzieć, badałem, czy wszystkie astrocyty podlegają jednakowym regułom rozmieszczenia (innymi słowy, czy wszystkie komórki tego typu mieszczą się we wspomnianych wcześniej „domenach”). Wygląda na to, że nie do końca – wydają się istnieć dwie różne subpopulacje gleju, posiadające cechy astrocytów (takie jak ekspresja specyficznych białek, np. S100B). Jedna z nich to klasyczne, domenowo rozmieszczone astrocyty, druga grupa z kolei składa się z mniejszych komórek, które same nie tworzą domen i nie respektują domen swoich „zwykłych” sąsiadów. Jednym z możliwych wyjaśnień takiej sytuacji jest istnienie podgrupy astrocytów o częściowo odmiennej funkcji. Dodatkowo zmienność astrocytów w skali całego mózgu (nie tylko w obrębie pojedynczych struktur) może również odgrywać ważną rolę. Wskazuje na to obserwacja badaczy z grupy Berningera i Götz, że efektywność przeprogramowania astrocytów z kory mózgowej za pomocą dwóch zestawów genów, normalnie działających w różnych częściach mózgu (jak pamiętamy, tylko jeden z nich normalnie ulega ekspresji w grzbietowej części kresomózgowia, czyli przyszłej korze) była różna. Komórki pochodzące od astrocytów z „niepasującymi” genami Dlx2 i Mash1 różnicowały się wprawdzie w neurony odpowiedniego typu, lecz uzyskiwały końcowy, w pełni dojrzały fenotyp rzadziej od tych komórek, w których wywołano ekspresję Neurog2.

To ważne i ciekawe problemy, tym bardziej, że chociaż astrocyty są jednymi z najliczniejszych komórek w mózgu i choć ciągle znajdujemy kolejne poszlaki, że są istotnym elementem w etiologii różnych schorzeń – nadal wiemy o nich stosunkowo mało. Podstawy biologii astrocytów czekają na opisanie: jaka jest żywotność pojedynczego astrocytu, jak i kiedy są zastępowane nowymi, jak przebiega rozwój tych komórek na wczesnym etapie, jakie sygnały sterują ich dojrzewaniem, przyjmowaniem przez nie skomplikowanej, domenowej morfologii i jakie sygnały są konieczne i wystarczające do ich reaktywacji w razie urazu mózgu, wreszcie, w jakim stopniu wspomniane przejawy heterogenności astrocytów są kluczowe dla ich funkcji? Nawet jeśli neurony otrzymywane z modyfikowanych astrocytów nie spełnią pokładanych w nich nadziei jako narzędzie terapeutyczne, zaawansowane narzędzia, stworzone z myślą o tym problemie, pozwolą nam na lepsze zrozumienie fundamentalnych kwestii w neurobiologii.