Kształcenie studentów Polaków oraz narastanie tendencji liberalnych przyniosły stopniową polonizację Uniwersytetu Lwowskiego i składu profesury. Antoni Małecki, filolog klasyczny, zaktywizował Katedrę Języka i Literatury Polskiej (od 1856). Władze zezwoliły na uruchomienie Bratniej Pomocy (1865) oraz Czytelni Akademickiej (1867). W wyniku pro memoria Agenora Gołuchowskiego (30 sierpnia 1866), co warunkowało objęcie przez niego urzędu namiestnika Galicji, wprowadzono w uniwersytecie możliwość wykładania w języku polskim. Postanowienie cesarza Franciszka Józefa (4 lipca 1871) – już po utworzeniu ck Austro−Węgier i nadaniu Galicji autonomii – stanowiło, że „wszelkie ograniczenia, jakie dotychczas stały na przeszkodzie odbywaniu polskich i ruskich wykładów na prawniczym i filozoficznym Wydziale Uniwersytetu Lwowskiego, mają odtąd całkowicie odpaść, a na katedry w tych fakultetach mogą być powoływane w przyszłości tylko osoby uzdatnione zupełnie do wykładania w jednym z obu języków krajowych”. Dla profesorów wykładających w języku niemieckim wyznaczono trzyletni okres przejściowy. Nie była to polityka równowagi, bowiem tylko dwie katedry prowadzone były w języku ruskim. Od postanowienia z 27 kwietnia 1879 roku procedury habilitacyjne miały być prowadzone w języku polskim. Po długiej batalii wprowadzono też język polski do kancelarii (postanowieniem z 27 kwietnia 1879). Powołano Katedrę Prawa Polskiego (1887) z Oswaldem Balzerem. Stanisław Starzyński w II tomie „Historyi Uniwersytetu Lwowskiego” (1894) wskazuje: „Dziś trudno było nawet pojąć, że Uniwersytet, który powinien być koroną drzewa, wyrosłego z pnia narodowego na narodowym gruncie, mógł być kiedyś koroną sztucznie przyczepioną, od innego organizmu odciętą, a tu nasadzoną”.

Polonizacja pobudziła dwa odmienne żywioły – w Radzie Państwa (parlament wiedeński) obradowano w 1876 roku nad likwidacją Uniwersytetu Lwowskiego wobec planu uruchomienia niemieckojęzycznego Uniwersytetu w Czerniowcach. Tu wystarczył opór profesury i władz Lwowa. Większe problemy wiązały się z narodowym ruchem ukraińskim, wyłaniającym się z formuły o Rusinach. Wśród studentów doliczono się w 1900 roku ok. 1300 Polaków i ok. 550 Rusinów. Od 1901 roku pojawiły się demonstracje ukraińskie, próby bojkotu oficjalnej inauguracji, hasła uczelni narodowej. Struktura języka wykładowego w roku 1906 była zróżnicowana – 185 wykładów w języku polskim, 19 – w ruskim, 14 – po łacinie, 5 – po niemiecku. 1 lipca 1910 doszło do walk między studentami – Ukraińcy użyli nawet broni palnej. Władze musiały przejść do polityki represji. Grono profesorskie było już, poza wyjątkami, polskie, jego liczebność wzrastała z 39 osób (1871) do 79 (1894) i 130 (1906).

Uniwersytet Lwowski korzystał ze wsparcia autonomicznych władz i pozycji własnych profesorów robiących kariery ministerialne w Wiedniu, ale i ze wsparcia społeczeństwa – arystokracji, ziemiaństwa i władz miasta Lwowa. Znaczące było też poparcie Kościoła rzymskokatolickiego. W roku 1884 Biblioteka Uniwersytecka otrzymała ok. 10 tys. tomów z zapisu ks. Michała Formaniosza. Nie zorganizowano obchodów 100−lecia uniwersytetu, a jedynie postanowiono opracować jego historię. Efektem studiów historycznych było przywrócenie dawnych tog i biretów podczas uroczystości, choć na co dzień pozostały mundury. W 1888 roku założono fundację „Dom Akademicki”, a władze wykupiły dzierżawiony budynek konwiktowy.

Na mocy postanowienia z 25 października 1891 uruchomiono, od roku akademickiego 1894/1895, Wydział Lekarski, przeznaczając na kliniki Szpital Krajowy i nowe budynki, postawione na koszt skarbu państwa i władz miasta. W 1897 roku oddano do użytku nowy gmach dla Zakładu Fizycznego, kosztownie go wyposażając, tak by uruchomić badania z zakresu fizyki doświadczalnej.

W 250−lecie założenia Uniwersytetu Lwowskiego (taki horyzont obrano w 1912 roku) Franciszek Jaworski zauważył w zarysie historii uczelni, że uniwersytet jest „potężną twierdzą ducha polskiego, czujną strażnicą u wschodnich rubieży Polski, jest jasnym ogniskiem wiedzy, prawdy i kultury, dostojną siedzibą nauki”. Pracuje także „za te uniwersytety, które być na ziemi polskiej powinny, a których nie ma”.

Po odzyskaniu niepodległości, decyzją ministra WRiOP z 18 listopada 1918, nadano najważniejszej uczelni miano Uniwersytetu Jana Kazimierza. Zajęcia inaugurowano, ze względu na kampanie wojenne, dopiero 25 października 1919. Inaugurując rok 1924/1925, rektor Włodzimierz Sieradzki stwierdzał: „Blisko siedem tysięcy studentów to zastęp ogromny, to armia, która dla samej ewidencji wymaga wielkiego a sprawnego aparatu administracyjnego, a cóż dopiero mówić o spełnieniu zadań pedagogicznych”.

Uczelnia walczyła od 1920 roku o przyznany jej na główną siedzibę gmach posejmowy. W wyniku reformy ogólnokrajowej Wydział Filozoficzny podzielono (1 października 1924) na dwa wydziały: humanistyczny oraz matematyczno−przyrodniczy. Studium Farmaceutyczne przeniesiono na Wydział Lekarski.

Narastające trudności budżetowe przy rosnących potrzebach uczelni oraz walka w obronie autonomii doprowadziły do napięć, powiększanych o konflikty narodowościowe wśród studentów UJK. Ten stan załagodził minister Wojciech Świętosławski. Na uroczystym posiedzeniu Towarzystwa Naukowego we Lwowie (10 marca 1936) wskazywał: „musimy się otrząsnąć nie tylko z apatii, ale opanować ducha ciągłego protestu, ciągłego niezadowolenia ze wszystkiego”. Przyjęto plany, co ilustruje tytuł publikacji z materiałami tego posiedzenia „O program pracy naukowej i oświatowo−kulturalnej Lwowa i województw południowo−wschodnich Rzeczypospolitej” (1936), które jednak unicestwiły kolejna wojna i geopolityka.