Okrzemki (Bacillariophyceae) są grupą jednokomórkowych organizmów fotoautotroficznych. Należą do Heterokontophyta (Stramenopiles), w obrębie których tworzą wspólny klad z bolidofitami (Bolidophyta-Parmales). Najbardziej charakterystyczną cechą okrzemek jest tzw. pancerzyk, składający się z dwóch okryw i ściśle ze sobą połączonych elementów pasa obwodowego. U większości gatunków okrzemek pancerzyk ten jest misternie ornamentowany wieloma różnorodnymi strukturami. Szacuje się, że liczba żyjących gatunków okrzemek wynosi 100-200 tysięcy. Pod względem liczby gatunków okrzemki są zatem drugą (po roślinach kwiatowych) grupą producentów pierwotnych na Ziemi. Produkcja pierwotna okrzemek jest podstawą całego łańcucha troficznego w strefie fotycznej wszystkich oceanów i jezior. Jako grupa organizmów okrzemki są niezwykle zróżnicowane i posiadają ogromny potencjał adaptacyjny. Są zdolne do przetrwania w szerokim zakresie warunków środowiskowych, wymagając jedynie minimalnego natężenia światła, aby móc prowadzić fotosyntezę. Okrzemki występują w licznych, niezwykle zróżnicowanych siedliskach wodnych i lądowych, odgrywając jednocześnie bardzo ważną rolę ekologiczną w skali całego globu w procesie wiązania węgla oraz produkcji tlenu atmosferycznego. Globalny udział okrzemek w tych niezwykle ważnych procesach szacowany jest na 20-40%. Wyniki badań prowadzonych nad okrzemkami w ostatnich latach wskazują również na ich ogromny potencjał aplikacyjny w takich dziedzinach gospodarki, jak przemysł biopaliw, inżynieria materiałowa, przemysł spożywczy, farmacja czy medycyna, obok znanych od wieków zastosowań, np. w procesach filtracji.

Okrzemki, z początku badane z wykorzystaniem mikroskopu świetlnego, są znane nauce od przełomu XVIII i XIX wieku. Niektóre pytania postawione w tym wczesnym etapie badań są aktualne do dziś, pomimo niesłychanego postępu technologicznego. Do tego rodzaju fundamentalnych pytań z zakresu diatomologii należą np. kwestie bioróżnorodności (liczby rodzajów, liczby gatunków) czy geograficznego rozprzestrzenienia poszczególnych taksonów. Nawet postęp spowodowany wykorzystaniem markerów molekularnych nie wniósł wiele nowego do wiedzy na temat biogeografii okrzemek, jako że ogólna koncepcja gatunku w tej grupie organizmów jest nadal przedmiotem naukowej dyskusji. Jednym z powszechnie akceptowanych kryteriów rozgraniczania gatunków jest zdolność do rozmnażania płciowego, jednakże ta cecha u okrzemek jest bardzo słabo zbadana i była przedmiotem badań u zaledwie kilkuset spośród – jak mówią szacunki – setek tysięcy gatunków.

Hodowla morskich okrzemek bentosowych na Wydziale Nauk o Ziemi Uniwersytetu Szczecińskiego (WNoZ) powstała na potrzeby realizacji grantu badawczego „Taksonomia i biogeografia morskich okrzemek bentosowych: czy rzeczywiście wszystko występuje wszędzie? Próba określenia możliwych mechanizmów dyspersji”, finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Grant ten był realizowany na WNoZ US w Zakładzie Paleooceanologii w latach 2010-2013. W tym czasie zakupiono komorę klimatyczną (fitotron) oraz drobny sprzęt niezbędny do izolacji pojedynczych komórek okrzemek z żywych prób pobieranych w terenie.

W 2012 roku zespół uzyskał z NCN, w ramach programu MAESTRO, grant zatytułowany „Zespoły okrzemkowe (Bacillariophyta) morskiej strefy litoralnej w wymiarze regionalnym i globalnym w świetle analizy morfologicznej oraz genetycznej. Implikacje filogenetyczne, biogeograficzne oraz taksonomiczne”. Projekt ten zakończył się w 2016 roku. Uzyskane środki pozwoliły na zakup zestawu do ekstrakcji DNA oraz reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), elektroforezy i dokumentacji żeli. W kwietniu 2016 roku hodowla okrzemek została przeniesiona do pomieszczeń w nowo wybudowanym budynku Centrum Dydaktyczno-Badawczego Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Szczecińskiego przy ul. Mickiewicza 16a. Budowa została sfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach programu operacyjnego Infrastruktura i Środowisko.

Oprócz dwóch wspomnianych projektów, na podstawie hodowli okrzemek realizowanych jest (lub zostało zakończonych) kilka innych projektów, finansowanych nie tylko przez NCN i NCBR, lecz także przez Chińską Akademię Nauk, Uniwersytet w Gunsan w Korei Południowej, Uniwersytet Króla Abdulaziza w Dżudzie w Arabii Saudyjskiej, a także ze środków na współpracę zagraniczną polsko-chińską oraz w ramach Horyzontu 2020. Ten ostatni projekt został zakwalifikowany do finansowania przez Komisję Europejską. Kilka projektów realizowanych jest w ramach współpracy dwustronnej, np. z Aquatic Ecosystems, Institute for Food and Agricultural Research and Technology (IRTA) w Sant Carles de la Rapita, Catalunya (Hiszpania), z University of Texas w Austin oraz University of Colorado w Boulder (USA). Na podstawie wyników badań prowadzonych na materiale z hodowli powstały w części dwie prace doktorskie (dr Ana Car, Uniwersytet w Dubrowniku; dr Ana Gomes, Uniwersytet Algarve), cztery dalsze (mgr Przemysław Dąbek, mgr Chunlian Li, mgr Ewa Górecka oraz mgr Marta Krzywda z Uniwersytetu Szczecińskiego) są w trakcie realizacji. Badania w hodowli prowadzą również doktoranci i stażyści z zagranicy, m.in.: So-Yean Kim z Kunsan University w Korei Południowej, Phumlile Cotyiane z Nelson Mandela Metropolitan University w Port Elizabeth, RPA, Aydin Kaleli z Kütahya Dumlupina University w Turcji. Zakład Paleooceanologii prowadzi także współpracę krajową, m.in. z Uniwersytetem Gdańskim (Instytut Oceanografii) oraz Uniwersytetem Łódzkim (Katedra Algologii), w zakresie wspólnych badań nad zespołami okrzemek występujących w Zatoce Gdańskiej i w słonych źródłach Polski Środkowej.

Badania realizowane dzięki hodowli obejmują strefę litoralną wszystkich oceanów, włącznie z Arktyką i Antarktyką. Jednak najbardziej intensywne prace są prowadzone na wybrzeżach RPA i Namibii, Morza Śródziemnego oraz Oceanu Indyjskiego i zachodniego Pacyfiku. W trakcie ekspedycji badawczych (np. Madagaskar, Afryka Południowa, Namibia, Arabia Saudyjska, Morze Żółte, Portugalia, Azory, Morze Bałtyckie) równocześnie z poborem prób dokonywane są pomiary podstawowych parametrów środowiskowych. Do najciekawszych siedlisk z pewnością należą badane przez nas rafy koralowe, obszary strefy litoralnej z klimatu tropikalnego oraz wybrzeży strefy klimatu umiarkowanego. Od roku 2014 uczestniczymy w badaniach okrzemek „podróżujących na gapę” na żółwiach morskich z gatunku Caretta caretta. Próby te pobierane są dzięki współpracy z kolegami z Kütahya Dumlupina University oraz Pamukkale University w Denizli w Turcji. W roku 2016 próby z żółwi morskich pobierane są również w Chorwacji z północnego Adriatyku. Tutejsze żółwie przebywają w swego rodzaju lecznicy dla zwierząt.

Izolacja i hodowla okrzemek

Próby, pobierane przez członków naszego zespołu bądź przesyłane pocztą kurierską z trudno osiągalnych miejsc na kuli ziemskiej, dostarczane są z reguły w ciągu kilku (maksymalnie kilkunastu) dni do laboratorium w Szczecinie. Pobierane są głównie ze strefy brzegowej o głębokości wody do kilkudziesięciu centymetrów. Zazwyczaj jest to piasek lub mułek z dna, często mieszanina piasku i mikroorganizmów zeskrobana z powierzchni skał, fragmenty makroglonów lub próby planktonu.

Z prób dostarczonych do laboratorium część materiału zostaje przeniesiona do szalki Petriego i zalana pożywką hodowlaną f/2, w celu wzbogacenia w taksony będące przedmiotem zainteresowania. Po ok. 7-14 dniach, kiedy liczebność pożądanych taksonów jest odpowiednia do izolacji, pojedyncze komórki takich okrzemek zostają wyciągnięte z próby przy pomocy szklanej mikropipety. Następnie wyizolowane komórki zostają oczyszczone z zanieczyszczeń i ewentualnych domieszek innych taksonów i przeniesione do nowej szalki. Po dwóch-trzech tygodniach sprawdza się, czy hodowle są wolne od domieszek innych (niepożądanych) taksonów. Kiedy w szalce występuje czysta kultura reprezentująca jeden gatunek, zostaje nadany jej kolejny dostępny numer w indeksie kolekcji. Szczep taki zostaje włączony do kolekcji i zdeponowany w specjalnie do tego celu przeznaczonych przeszklonych szafach chłodniczych. O tym, jakie umiejętności i opanowanie muszą posiadać osoby izolujące komórki okrzemek, niech świadczy fakt, iż izolacja odbywa się w mikroskopie odwróconym z użyciem obiektywu x 4, powiększeniu okularów x 10. Rozmiary izolowanych okrzemek wahają się od 1-2 do ok. 50-100 µm. A jednak udaje się.

Warunki, w jakich szczepy okrzemek przetrzymywane są w hodowli (temperatura ok. 10°C), sprawiają, że poszczególne szczepy charakteryzują się bardzo wolnym wzrostem i wymagają przesadzania co kilka miesięcy. Dzięki temu możliwe jest ich dalsze utrzymywanie przy życiu. Na wszelki wypadek każdy szczep deponowany w kolekcji poddawany jest rutynowo dokumentacji fotograficznej (żywe komórki, oczyszczone komórki w mikroskopie świetlnym i elektronowym), z każdego szczepu ekstrahowane i amplifikowane jest DNA. Te czynności, zwłaszcza ekstrakcja i amplifikacja DNA, wykonywane są ściśle według protokołu. DNA przechowywane jest w zamrażarce.

DNA – ekstrakcja i amplifikacja

Żywe okrzemki z hodowli są często obserwowane przy użyciu dużych powiększeń w mikroskopie świetlnym (x 1500) w celu zilustrowania chloroplastów. Rutynowo z części komórek z czystej kultury sporządzone zostają preparaty do mikroskopu świetlnego i elektronowego. Na podstawie dokumentacji z mikroskopu świetlnego i elektronowego przeprowadzana jest identyfikacja okrzemek z hodowli.

Kolejnym etapem badań nad wyizolowanymi okrzemkami jest ekstrakcja i amplifikacja DNA. W zależności od zagęszczenia hodowli, kilka mililitrów zawiesiny komórek z hodowli w fazie eksponencjalnego wzrostu zostaje poddanych odwirowaniu w celu ekstrakcji komórkowego DNA. Do tego celu wykorzystywany jest gotowy zestaw do ekstrakcji. Geny z jądra komórkowego oraz z chloroplastów są poddawane amplifikacji. Produkty PCR są wysyłane do Pracowni Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydów w Instytucie Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie i poddawane sekwencjonowaniu metodą Sangera, BigDye Terminator v. 3.1 oraz ABI3730 xl.

Analiza filogenetyczna

Na podstawie wyników uzyskanych z sekwencjonowania opracowywane jest drzewo filogenetyczne danej grupy okrzemek. W opublikowanych w ostatnich latach pracach przyjęliśmy metodę najwyższego prawdopodobieństwa (Maximum Likelihood, ML) jako najlepsze pod względem statystycznym przybliżenie do konstrukcji drzew filogenetycznych (np. Li i in. 2015, Witkowski i in. 2016). Drzewo, przy użyciu metody maksymalnego prawdopodobieństwa, powstaje w wyniku połączenia (konkatenacji) danych uzyskanych z badanych okrzemek z wykorzystaniem trzech genów. Drzewo o najwyższej wartości prawdopodobieństwa wybierane jest jako ostateczne drzewo filogenetyczne, a w poszczególnych węzłach podawane są wartości wsparcia.

W naszej hodowli morskich okrzemek bentosowych ze strefy litoralnej wyizolowanych zostało dotychczas jako czyste szczepy ok. 1600 taksonów ze wszystkich oceanów. (Informacja na temat taksonów oraz ich pochodzenia geograficznego dostępna jest na stronie http://geocentrum.usz.edu.pl/zaklad-paleooceanologii/.) Jest to największa tego typu hodowla w Polsce oraz jedna z niewielu, na tak wielką skalę, na świecie. W związku z realizacją kolejnych projektów oraz chęcią współpracy naukowców z zagranicznych instytucji rośnie liczba izolowanych klonów. Spodziewamy się, że wydolność zespołu osiągnie wkrótce granicę możliwości. Konieczne będzie podjęcie decyzji, czy nadal utrzymujemy przy życiu poszczególne szczepy, czy np. sięgniemy po metodę zamrażania w temperaturze minus 81°C?

Zgromadzone w hodowli okrzemek w Uniwersytecie Szczecińskim taksony oraz dotyczące ich metadane stały się podstawą do zainicjowania badań metagenomicznych. Badania metagenomiczne, w przeciwieństwie do barkodingu i metabarkodingu, obejmują dane środowiskowe do poszczególnych taksonów, dokumentację morfologiczną (dane strukturalne i ultrastrukturalne na najwyższym możliwym poziomie), dane cytologiczne oraz markery molekularne. Markery molekularne wykorzystywane są do tworzenia łączonych (konkatenowanych) drzew filogenetycznych, mających na celu określenie pozycji filogenetycznej badanych taksonów oraz ich przynależności taksonomicznej. W ten sposób powstała baza referencyjna, która będzie w przyszłości służyć identyfikacji taksonów okrzemek bentosowych z morskiej strefy litoralnej, a w odniesieniu do sporej grupy taksonów już jest dostępna. Część danych odnośnie do markerów molekularnych została już opublikowana (Li i in. 2015, 2016, Witkowski i in. 2016, Dabek i in. w druku) i są dostępne w GenBanku (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Ogółem baza danych wykorzystywana w badaniach metagenomicznych i zawierających pełne, wyżej wymienione informacje liczy w tej chwili ok. 1000 szczepów. Dane te mogą być bezpłatnie wykorzystywane przez innych naukowców z całego świata na zasadach współpracy naukowej. Obecnie niewiele ośrodków na świecie prowadzi tego typu badania ze względu na duże nakłady finansowe i dużą ilość danych do przeanalizowania.

W opublikowanych już kilku pracach bazujących głównie na własnych szczepach udało się nam udokumentować nowe rodzaje i gatunki. Podejmujemy badania na poziomie dużych jednostek taksonomicznych, głównie o randze rodzin. Wyniki naszych badań z zastosowaniem tradycyjnych metod analizy morfologicznej i metod biologii molekularnej rzuciły nowe światło i uporządkowały wiedzę na temat kilku rodzin okrzemek, m.in. Plagiogrammaceae, Cymatosiraceae oraz Fragilariaceae. Ważnym odkryciem naukowym było wykazanie przez nasz zespół, że pewne cechy – typ rafy (szczeliny) kanałowej u okrzemek – powstawały w wyniku odrębnych procesów ewolucyjnych i mimo podobieństwa w obrębie określonych rodzin czy rzędów wyewoluowały one niezależnie od siebie i są przykładem homoplazji. W kontekście zmian środowiskowych w strefie litoralnej mórz i oceanów, wywołanych zmianami klimatycznymi, nasze badania mają fundamentalne znaczenie dla określenia istniejącej bioróżnorodności morskich bentosowych zespołów okrzemkowych. Z jednej strony dokumentujemy istniejącą bioróżnorodność, przechowujemy materiał genetyczny na przyszłość, z drugiej zaś, udostępniając sekwencje współczesnych taksonów, umożliwiamy badania nad bioróżnorodnością zespołów okrzemkowych w przeszłości. Jest to możliwe dzięki coraz częściej prowadzonym badaniom osadów morskich z wykorzystaniem zdeponowanego w nich DNA.

Błękitna biotechnologia

Hodowla morskich okrzemek bentosowych wpisuje się w kilka interdyscyplinarnych kierunków badań stosowanych. Badania prowadzone na bazie szczepów wyizolowanych w hodowli Zakładu Paleooceanologii zmierzają w kierunku wydzielenia taksonów bogatych we frakcje lipidowe (lipidy są materiałem zapasowym u okrzemek). Najbogatsze nasze szczepy charakteryzują się zawartością lipidów przekraczającą 50-60% objętości komórki. Hodowla wyselekcjonowanych szczepów umożliwi produkcję biooleju na skalę laboratoryjną, a następnie półprzemysłową. Polska, jako kraj członkowski Unii Europejskiej, zobowiązana jest do zwiększenia udziału składników pochodzenia biologicznego w produkcji paliw. Obowiązek ten regulują odpowiednie przepisy prawa UE. Wielką zaletą produkcji oleju z okrzemek jest fakt, iż jest to źródło niebędące produktem żywnościowym w przeciwieństwie do rzepaku, pszenicy czy innych zbóż. Współpraca pod tym kątem prowadzona jest z PKN Orlen i z Uniwersytetem Warmińsko-Mazurskim w Olsztynie.

Pierwsze próby wykonane w warunkach laboratoryjnych przy współpracy z Wydziałem Inżynierii Materiałowej oraz Wydziałem Chemii Politechniki Warszawskiej wskazują na występowanie w hodowlach okrzemkowych szeregu interesujących materiałów. Są to głównie kwasy tłuszczowe, wielkocząsteczkowe węglowodany, proteiny. Wyniki tych badań wymagają testowania w hodowli na większą skalę i odpowiednie kroki w tym zakresie zostały już podjęte. Interesujący jest także fakt, iż okrzemki wytwarzają cały szereg związków chemicznych niezwykle cennych dla przemysłu farmaceutycznego, są to m.in. chitosan oraz modne dziś kwasy omega 3 i omega 6.

Najświeższy temat, czyli produkcja na dużą skalę mareniny, jest głównym celem projektu zakwalifikowanego do finasowania przez Komisję Europejską w ramach programu Horyzont 2020. Marenina jest barwnikiem wytwarzanym przez tzw. błękitne okrzemki (np. Haslea ostrearia) i niebiorącym udziału w procesie fotosyntezy. Uboczny efekt masowego rozwoju H. ostrearia pośrednio znany był od dawna koneserom ostryg, głównie z rejonu Marenne-Oleron we Francji, z racji ich intensywnie zielonej barwy. Stanowią one atrakcję kulinarną i przez smakoszy spożywane są w towarzystwie dobrego wina – czy to Muskadet, czy Chardonnay. Zielone ostrygi nie są tanie. Posiadane w hodowli szczepy Haslea, potencjalnie wyizolowane w trakcie trwania projektu, będą hodowane na dużą skalę. Opracowana zostanie również metoda ekstrakcji mareniny z dużej ilości biomasy błękitnych okrzemek z rodzaju Haslea.

Siły, środki i zasoby

Obecnie hodowla utrzymywana jest przy życiu przez trzy osoby zatrudnione na stałe i czworo doktorantów. Tymi siłami wykonywane są prace począwszy od poboru prób po ekstrakcję DNA i uzyskanie sekwencji oraz interpretację uzyskanych wyników czy wreszcie eksperymenty krzyżowania różnych szczepów. W tym zespole wykonywane są wszystkie prace techniczne, przygotowanie pożywek, wykonywanie dokumentacji fotograficznej oraz reinokulacja szczepów. Jest co robić. Sporą pomoc stanowią osoby odbywające staże w Zakładzie Paleooceanologii. Nie sposób przecenić współpracę międzynarodową, zawiązaną przy okazji wspólnych badań. Część pracy, czy to analitycznej, czy technicznej, wykonywana jest wspólnie. Bez wątpienia laur za stworzenie tak dużej hodowli należy się doktorantom. To głównie oni wykonują izolację, a następnie przesiewy szczepów, które zostały dotychczas wyizolowane. Praca ta musi być wykonywana na bieżąco, pomimo że każdy z nich ma także swoje obowiązki. Doktoranci realizują jednocześnie badania do swoich prac doktorskich.

Dzięki szczęśliwemu zbiegowi okoliczności na mapie naukowej Polski powstała unikatowa hodowla, która ma szansę na rozwój interesujących badań w Polsce i na silny impuls wzmacniający pozycję polskiej jednostki naukowej we współpracy międzynarodowej. Pisząc ten tekst miałem zamiar, aby zainteresować szczecińską hodowlą okrzemek krajowe środowisko naukowe. Wyrażam nadzieję, że taka współpraca zostanie nawiązana, a łamy „Forum Akademickiego” mogą się do tego przyczynić.