Zanieczyszczenie środowiska naturalnego substancjami wytworzonymi przez człowieka to problem, z którym ludzkość mierzy się od zarania dziejów, jednak dopiero od czasów drugiej rewolucji przemysłowej, czyli przełomu XIX i XX wieku, problem ten przerodził się w realne zagrożenie dla przyrody. Dzięki skonstruowaniu silnika benzynowego w 1876 roku przez Nicolausa Augusta Otto oraz silnika dieslowskiego w 1893 roku przez Rudolfa Diesla, transport samochodowy, kolejowy i morski rozwinęły się do rozmiarów, o jakich nikt z ówczesnych konstruktorów nawet nie śnił. Paliwa kopalne stanowią i przez najbliższe lata nadal będą stanowić podstawowe źródło energii napędzające rozwój cywilizacyjny. Ropa naftowa pozostaje najważniejszym surowcem do wytwarzania ciekłych paliw silnikowych. Choć jest to substancja niezwykle użyteczna jako paliwo, działa toksycznie na większość organizmów żywych. Na większość, ale nie na wszystkie.

Błyskawiczny rozwój przemysłu naftowego w Stanach Zjednoczonych doprowadził w 1926 roku do przełomowego odkrycia. Naukowcy badający głowice wiertnicze tamtejszych szybów naftowych odnaleźli w ich otoczeniu bakterie. Nikt z uczonych nie przypuszczał wówczas, że ropa naftowa może być przyjaznym miejscem do życia dla wielu różnych mikroorganizmów. Ich pojawienie się wiązano raczej z obecnością wody służącej do chłodzenia głowic lub solanki towarzyszącej pokładom ropy. Późniejsze badania rozwiały jednak wątpliwości – węglowodory nie tylko mogą być użytecznym paliwem do napędzania pojazdów, ale stanowią również wysokoenergetyczny pokarm dla niektórych rodzajów bakterii, grzybów, drożdży czy glonów. Dopiero w latach 70. i 80. ubiegłego wieku poważniej zainteresowano się bakteriami pobierającymi energię z rozkładu węglowodorów ropopochodnych, gdy zaczęto je powszechniej wykorzystywać do oczyszczania środowiska z paliw silnikowych, które przedostały się do niego na skutek awaryjnych wycieków tankowców czy cystern. Jednym z punktów zwrotnych była katastrofa przewożącego ropę naftową tankowca Exxon Valdez w 1989 roku. Wyciek wywołał poważne naruszenie równowagi ekologicznej wrażliwego ekosystemu morskiego i doprowadził do skażenia linii brzegowej pobliskiej Alaski. Gdy po kilkunastu latach od tego wydarzenia pobrano próbki gleby z zanieczyszczonego wybrzeża, odnotowano znaczny spadek stężenia szkodliwych węglowodorów w stosunku do tego, jaki zarejestrowano tuż po katastrofie. Wszystko to było zasługą naturalnie występujących szczepów mikroorganizmów, które pobudzono do intensywnego wzrostu przy użyciu nawozów mineralnych zawierających azot i fosfor.

Witamy w świecie mikroorganizmów

W świecie drobnoustrojów panują podobne reguły do tych spotykanych w świecie bardziej rozwiniętych organizmów, a nawet ludzi. Cenny łup przypada zazwyczaj osobnikom najsilniejszym lub posiadającym unikatowe zdolności. Choć walka bakterii o przetrwanie jest niewidoczna gołym okiem, to liczebność mikroskopijnych wojsk konkurujących o pokarm jest zdecydowanie wyższa niż w przypadku jakichkolwiek innych organizmów. W jednym gramie gleby żyje przeciętnie od kilku milionów do kilku miliardów bakterii. Są one gwarancją bezodpadowego samooczyszczania się środowiska ze szczątków roślin, zwierząt, ale również z substancji bardziej toksycznych, w tym wytworzonych przez człowieka.

Ponieważ wycieki ropy naftowej i paliw silnikowych są głównym źródłem skażeń środowiska, to właśnie na nich ekolodzy skupiają swoją uwagę. Olej napędowy składa się w przybliżeniu z 3 tysięcy różnych węglowodorów należących zarówno do frakcji alifatycznej, cykloalifatycznej, jak i aromatycznej. Gdy w danym ekosystemie pojawiają się te toksyczne związki, niewielka grupa drobnoustrojów rozpoczyna mikroskopijną batalię o każdy cenny składnik zanieczyszczenia. Wśród bakterii żywiących się węglowodorami występują różnorodne gusta pokarmowe, czyli tzw. preferencje substratowe. Oznacza to, że niektóre mikroorganizmy chętniej przyswajają alkany, a inne węglowodory aromatyczne, stanowiące dla wielu innych drobnoustrojów barierę nie do przejścia. Zaobserwowane preferencje mogą być również rezultatem konkurencji pomiędzy różnymi gatunkami bakterii. Niektóre dysponują bowiem dodatkowym atutem w postaci „substancji bojowych” własnej produkcji, którymi mogą się posłużyć na wypadek wizyty nieproszonych gości – najczęściej bakterii innego gatunku. Przegranym pozostaje wówczas nacieszyć się mniej lubianym pokarmem.

Życie mikroorganizmów to nie tylko niekończąca się rywalizacja o każdy składnik pokarmowy i nanometr przestrzeni życiowej. Jak pokazują badania, bakterie tworzą złożone społeczności, wśród których pojedyncze osobniki współpracują ze sobą, co ułatwia im przetrwanie w trudnych warunkach środowiska. Łączenie się drobnoustrojów do postaci kolonii pozwala im efektywniej rywalizować z innymi gatunkami bakterii, a także wspomaga ochronę przed potencjalnymi drapieżnikami. Żaden mikroorganizm nie jest samotną wyspą na oceanie świata przyrody nieożywionej. W warunkach naturalnych bakterie tworzą również wielogatunkowe konsorcja, w których każdy gatunek pełni odrębną i jednocześnie istotną rolę w funkcjonowaniu złożonego ekosystemu. Próby wykorzystania pojedynczych szczepów bakterii, które wykazują dużą zdolność do rozkładu węglowodorów, w celu oczyszczania środowiska naturalnego z paliw, kończą się zazwyczaj niepowodzeniem. Często wyhodowane w laboratorium mikroorganizmy nie wytrzymują konkurencji ze strony zróżnicowanych konsorcjów bakteryjnych, od dawna obecnych w zanieczyszczonym ekosystemie. Co dzieje się w świecie mikroorganizmów, gdy dochodzi do skażenia? Czy konsorcja bakteryjne są na tyle wytrzymałe, by poradzić sobie ze zmianami pokarmu? Na te wszystkie pytania miały odpowiedzieć wyniki przeprowadzonych przeze mnie badań.

Szef kuchni poleca – węglowodory ropopochodne

Zasada eksperymentów była prosta. Miałem określić preferencje substratowe poszczególnych gatunków bakteryjnych wchodzących w skład środowiskowego konsorcjum bakteryjnego i powiązać to z wydajnością rozkładu oleju napędowego. Badane konsorcjum zostało wyizolowane z miejsca, w którym gleba od ponad stu lat jest nasycona ropą naftową, czyli z… polskich Bieszczad – to tutaj powstały bowiem jedne z pierwszych szybów naftowych na świecie. Skład gatunkowy wyizolowanego konsorcjum został określony dzięki użyciu metody sekwencjonowania 16S rRNA, która pozwala na identyfikację gatunków bakterii na podstawie analizy małego fragmentu rybosomu (16S). Ten fragment stanowi swego rodzaju „odcisk palca” danej bakterii i pozwala na rozpoznanie, z jakim mikroorganizmem mamy do czynienia. Otrzymane wyniki wykazały, że w ramach konsorcjum współistnieje ze sobą 7 głównych grup taksonomicznych bakterii: Achromobacter, Alcaligenes, Citrobacter, Comamonadaceae, Sphingobacterium, Pseudomona i Variovorax.

Teraz wystarczyło tylko wyhodować konsorcjum na oleju napędowym i przyjąć zamówienia od każdej grupy mikroorganizmów na wybrane frakcje węglowodorów. Żeby jednak można było sprawdzić, co preferuje dany rodzaj bakterii, musiałem podzielić wyhodowaną biomasę bakteryjną na 25 części, a następnie do każdej dodać niewielką ilość specyficznego źródła węgla, czyli po prostu pojedynczego węglowodoru, np. heksadekanu. Użyte zostały różne węglowodory alifatyczne, cykloalifatyczne oraz aromatyczne, które dobrze reprezentowały poszczególne składniki wchodzące w skład przeciętnego oleju napędowego spotykanego na stacjach paliw. Hodowla mikroorganizmów na pojedynczych węglowodorach w płynnym medium mineralnym trwała 7 dni. Następnie biomasę przemywałem i po raz kolejny prowadziłem hodowlę w identycznych warunkach. Łącznie wykonałem aż 5 takich powtórzeń, tak aby bakterie dobrze zapoznały się z nowym pokarmem. Jaki był ich cel? Zilustrujmy to na przykładzie sałatki owocowej, wyobrażającej olej napędowy. W środowisku naturalnym każdy mikroorganizm musi stawić czoło mieszaninie związków występujących w danym paliwie, tak jak człowiek mieszance owoców w sałatce. Co jednak się stanie, gdy przez dłuższy czas będziemy karmić bakterie tylko jednym związkiem? Czy nadal będą chętne do rozkładu całej węglowodorowej „sałatki”?

Sprawdzając, jak po wszystkim zmieniła się liczebność danych mikroorganizmów, mogłem określić, przy których węglowodorach rosną dobrze, a przy których obumierają. Niestety policzenie bakterii to nie lada wyzwanie. Z pomocą po raz kolejny przyszły metody biologii molekularnej, a konkretniej ilościowa metoda wykorzystująca reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (quantitative real-time PCR). Aby jednak można było ją wykorzystać, niezbędna była synteza specyficznych sond molekularnych i markerów, dzięki którym możliwe było zwielokrotnienie materiału genetycznego każdego rodzaju bakterii. Długo oczekiwane wyniki nie zawiodły. Każdy rodzaj bakterii gustował w nieco innych związkach. I tak na przykład bakterie rodzaju Citrobacter dobrze wzrastały na węglowodorach alifatycznych, bakterie rodzaju Psuedomonas na węglowodorach aromatycznych, a bakterie rodzaju Achromobacter na węglowodorach cykloalifatycznych. Skład konsorcjum zmienił się w wyniku przeprowadzonych pasaży (kolejnych etapów hodowli), a najwięcej pojawiało się bakterii tego rodzaju, który preferował dany związek. W żadnej próbie nie zaobserwowałem jednak całkowitego „wyginięcia” danego rodzaju bakterii. Pomimo to, takie zmiany mogły mieć istotny wpływ na to, co się dzieje podczas rozkładu komercyjnych paliw, takich jak olej napędowy. Czy konsorcjum jest nadal na tyle silne, żeby zmierzyć się z większą liczbą węglowodorów naraz? Aby to sprawdzić, musiałem tylko, zamiast pojedynczych związków, przez kolejny okres dodawać do próbek olej napędowy.

Strażnicy zawsze w formie

Kolejne, trzykrotnie powtarzane przesiewy z wykorzystaniem oleju napędowego zajęły trzy tygodnie. Dokładnie tyle czasu miały bakterie, aby przystosować się po raz kolejny do mieszaniny węglowodorów. Warunki pozostały bez zmian, procedura była identyczna. Zmienił się tylko pokarm – na bogatszy. Po upływie 21 dni nadszedł czas na ostateczną próbę – testy biodegradacyjne w glebie. Pozwalają one określić, jak wydajnie bakterie rozkładają daną substancję. Konsorcjum bakteryjne, które było używane w badaniach już od ponad stu lat, zmagało się z ropą naftową znajdującą się w skażonej glebie z okolic bieszczadzkich szybów naftowych. Tego rodzaju mikroorganizmy pobierają węglowodory i pozyskują energię, a na zewnątrz wydzielają wodę i dwutlenek węgla. Pomiar wytworzonego CO2 był w tej chwili kluczem do rozwiązania zagadki moich badań. Testy biodegradacyjne przeprowadzane w naszym laboratorium polegają na miareczkowaniu potencjometrycznym roztworu NaOH, który przereagował z dwutlenkiem węgla dając Na2CO3. Roztwór ten jest umieszczany w małym naczynku wewnątrz zamykanej butli z glebą, olejem napędowym, medium mineralnym i bakteriami. Pomiaru dokonuje się co kilka dni. Przeprowadzone przeze mnie testy trwały cztery tygodnie. Przedtem wykonałem identyczne pomiary wydajności biodegradacji dla wyjściowego konsorcjum przed zmianą „diety”. Teraz wypadało tylko porównać oba wyniki biodegradacji – przed i po pasażach.

Świat mikroorganizmów to pasjonująca przestrzeń pełna niewiadomych, którą cechuje jednak pewne uporządkowanie. Siła bakterii tkwi nie tylko w ich liczbie, ale również w ich zdolności do adaptacji do nowych warunków otoczenia. Wyniki moich badań pokazały, że każdy członek konsorcjum pełni wyjątkową i istotną rolę w rozkładzie szerokiej gamy związków obecnych w paliwach silnikowych. To dzięki różnorodności mikroorganizmów możliwe jest usunięcie niemal każdej substancji ze środowiska naturalnego. Otrzymane rezultaty dwóch serii testów biodegradacyjnych były niemal identyczne. Bakterie nadal chętnie rozkładały olej napędowy. Mechanizmy adaptacyjne tych nanometrycznych strażników ładu w przyrodzie wciąż napawają rzesze naukowców zdumieniem. Mnie napawają optymizmem, ponieważ wiem, że wiele jeszcze pozostało do odkrycia.