Cały mój naukowy świat to mały biały pokoik w równie małym białym gmachu MITR-u. Cały mój naukowy świat to niewielkie biureczko i równie niewielki spektrofotometr (o spektrofluorymetrze wspominała nie będę, choć chyba powinnam), dzięki któremu uzyskuję te wszystkie, niezwykle pasjonujące punkty izozbestyczne, przegięcia i wybudowujące się pasma. Ten niewielki spektrofotometr zmienił moje życie niespełna dwa lata temu i do dziś potrafi mnie nieźle zaskoczyć.

Kiedy rozpoczynałam moją przygodę z katalazą, byłam świeżo po ciekawym, aczkolwiek nie do końca pasjonującym spotkaniu z syntezą peptydów. Nie miałam pojęcia, czym owa katalaza w ogóle jest i czy warta jest mojego zainteresowania. Wiedziałam tylko tyle, że muszę coś zmienić, poszukać nowej ścieżki naukowej. Dziś o rzeczonej katalazie wiem już sporo, na pewno nie tyle, ile wiedzieć bym chciała i na pewno nie tyle, ile wie moja pani promotor, ale samo poszukiwanie nowych informacji, wertowanie kolejnych publikacji, obalanie dotychczasowych koncepcji ma w sobie to „coś”. I chyba właśnie o to w tym wszystkim chodzi, bo gdyby nie tajemne, wręcz mistyczne „coś”, nie pisałabym dziś o mojej pasji.

Dobrze naoliwiona maszynka

Katalaza to nasz enzym ochronny, swoista tarcza, za pomocą której organizm walczy z atakującymi go nieprzerwanie wolnymi rodnikami, a gwoli precyzji – z nadtlenkiem wodoru. Każdego dnia jemy, pracujemy, przemieszczamy się z miejsca na miejsce, stresujemy z byle powodu, a jednocześnie narażamy się na atak wolnych rodników. Mówi się o nich sporo, głównie w kontekście kremów przeciwzmarszczkowych i olejków do opalania. Nie twierdzę, że to źle, bo stara zasada głosi, że nieważne co mówią, ważne, że w ogóle mówią, ale tak naprawdę to nie zmarszczki są najważniejsze.

Nasz organizm to dobrze naoliwiona, niezwykle skomplikowana maszynka, nad którą nikt w pełni nie potrafi zapanować. W takiej maszynce ważny jest każdy trybik, każda zębatka, a nawet zwykła podkładka. Nietrudno sobie wyobrazić, co stałoby się z silnikiem samochodu, gdybyśmy nalali do diesla bezołowiowej 95. Znacznie więcej problemów stwarza nam dostrzeżenie zależności pomiędzy tym co jemy, a stanem naszego zdrowia. Nasz organizm kocha homeostazę, wszelkie ponad i poniżej są niepożądane, a często wręcz niebezpieczne. Bo przecież nawet te okropne wolne rodniki w niewielkich ilościach nasz organizm potrafi dobrze spożytkować – wykorzystuje je jako mediatory w procesach metabolicznych czy też jako pomocników w unieszkodliwianiu wirusów i bakterii. Dopiero nadprodukcja, szeroko pojęta nadkonsumpcja (celowa bądź przypadkowa, aczkolwiek często nieunikniona – bo któż z nas się nie stresuje) jest szkodliwa. Siła rażenia pojedynczego wolnego rodnika (zwłaszcza hydroksylowego, ●OH) potrafi być bardzo duża, a co dopiero całej atakującej brygady! Takiej armii cząsteczek trudno stawić opór, dlatego pod naporem nieprzyjaciela uszkodzeniu ulegają lipidy, białka, węglowodany i kwasy nukleinowe, czyli wszystkie kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania organizmu związki.

I tutaj zaczyna się moja bajka. Do ataku przystępują antyoksydanty, nasza prywatna wewnętrzna armia, która nawet za cenę własnego życia będzie broniła organizm przed wrogimi rodnikami i wszelkimi reaktywnymi formami tlenu, azotu etc. Nasze prywatne wojsko jest dość liczne, co więcej, złożone z dwóch podjednostek: dużej enzymatycznej (katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa – SOD, peroksydaza glutationowa) i mniejszej, będącej zbiorowiskiem małych endo– i egzogennych antyoksydantów (m.in. witaminy C i E, glutation, polifenole, w tym flawonoidy). Która podjednostka jest ważniejsza? Na to pytanie nie ma jednoznacznej odpowiedzi, bo w pojedynkę niewiele mogą, dopiero ich współdziałanie gwarantuje (a w warunkach homeostazy przynajmniej powinno gwarantować) pełną ochronę. Moja katalaza dzielnie walczy z nadtlenkiem wodoru (H2O2), SOD z anionorodnikiem ponadtlenkowym, nomen omen przekształcając go w H2O2 (jak sprytna była Matka Natura umieszczając oba te enzymy tuż obok siebie w peroksysomach), a wszystko po to, aby nasz organizm jak najdłużej był w dobrej formie.

Enzymy to potęga

Enzymy to olbrzymie, świetnie funkcjonujące fabryki. Surowiec dostarczany do produkcji w takiej fabryce musi być najwyższej klasy, jedna cegiełka podobna do drugiej, w przeciwnym wypadku trafi do zbiornika na odpady. Enzymów jest mnóstwo, każdy ma własną, niepowtarzalną funkcję, więc i liczba różnorodnych substratów krążących nieustannie po organizmie jest duża. Naturalnym substratem mojej katalazy jest nadtlenek wodoru, cząsteczka relatywnie mała, pozbawiona ładunku, niepolarna. Cząsteczka, która bez problemu pokonuje wąski, długi, hydrofobowy kanał prowadzący do centrum aktywnego katalazy (swoistego centrum dowodzenia enzymu), gdzie przekształcana jest w dwie cząsteczki wody i cząsteczkę tlenu. Chociaż brzmi to trywialnie, w rzeczywistości wcale takie nie jest, ale przecież nie o tym miałam pisać.

Przyglądanie się enzymom to moja praca. Obserwuję je niezwykle bacznie, czy aby przypadkiem nie zmieniły koloru, a może zaczęły opalizować… Ale nic z tych rzeczy, wszystko przebiega po mojej myśli, katalaza rozkłada kolejne cząsteczki nadtlenku wodoru, a w kiuwetce (naczyniu laboratoryjnym stosowanym do wykonywania pomiarów spektrofotometrycznych) pojawiają się pęcherzyki tlenu. Uff… Enzym jest nadal aktywny, mogę go wykorzystać do dalszych badań. Bo enzym też ma swoją datę ważności i kiedy po dodaniu go do nadtlenku wodoru bąbelki nie powstają, trzeba otworzyć kolejną kosztowną fiolkę. Ale tym razem wszystko jest w porządku, mogę rozpoczynać pomiary. Jeszcze tylko przygotuję kolejny flawonoid, dziś ECG (galusan epikatechiny, ang. epicatechin gallate). Przy wadze ręka nieco drży, bo w opakowaniu tylko 5 mg, a cena co najmniej jak za 5 kg. O nie, nie chce się rozpuścić w wodzie, a przecież na opakowaniu napisali, że się rozpuszcza (ile to już razy mówiłaś sobie, że nie będziesz wierzyła tym ulotkom…). Nic to, trzeba będzie podgrzać. Oby tylko związek się nie rozłożył… Ale przecież sami napisali, że można podgrzewać (a tak, miałam im nie wierzyć). Na szczęście sukces, klarowny roztwór, pora zarejestrować widmo absorpcyjne. Uff… pojedyncze pasmo – wszystko się udało. Jeszcze tylko przeliczyć stężenia, obliczyć objętości i już mogę ruszać do boju.

W kolejnych zlewkach stoją trzy prawie identyczne roztwory, tylko katalaza odróżnia się lekko brunatnym zabarwieniem. Odmierzam odpowiednie objętości (pipeta automatyczna to jest jednak wspaniały wynalazek) buforu (bo pH ma być neutralne, zbliżone do tego w organizmie człowieka), nadtlenku wodoru i ECG, pobieram 20 µl katalazy i… A nie, jeszcze nie, znów zapomniałam o odnośniku, zawartość kiuwetki do zlewek (bo najpewniej ECG już zaczęło się zaprzyjaźniać z H2O2, generując nowe związki), a sama kiuwetka do mycia. No to jeszcze raz, odnośnik gotowy, zarejestrowany (spektrofotometr już wie, na jakim tle namaluje mi widmo). Odmierzam kolejne roztwory, na koniec dodaję katalazę, mieszam zawartość kiuwetki błyskawicznie i klikam start. Zanik absorbancji nadtlenku wodoru gotowy, wyjmuję kiuwetkę, są i bąbelki, ale jakoś tak niezbyt wiele tym razem. Mój komputer dokonuje tajemnych obliczeń i wypluwa kolejne cyferki. Tak jak myślałam, ECG bardzo silnie hamuje aktywność katalazy, stąd tak mało bąbelków, a zanik jakiś taki niewielki. Ale przecież mogłam się pomylić albo jakaś kropelka nie wpadła do kiuwetki (przy 20 µl roztworu jedna kropelka to cały ogrom). Powtarzam. Wynik jest podobny. To jeszcze raz. Znów podobny. Czyli wszystko w porządku, mogę uśredniać. IC50 0,029 ± 0,02 µM – bardzo silny inhibitor.

Teraz jeszcze tylko poinkubuję ECG z katalazą przez kilka godzin, posprawdzam, co dzieje się z aktywnością katalazy w tym czasie i już mogę przygotowywać się do kolejnego etapu. Jest około 15:00, więc próbuję się pospieszyć, co oznacza, że złe nie śpi i na pewno coś wyleję. Znów przeliczam i odmierzam, tym razem ECG i katalazę w buforze, mieszam i obserwuję widmo enzymu (tak, tak, zmieniłam odnośnik, na pewno)… nie zmieniłam – wiedziałam, że jak się człowiek spieszy, to wiadomo co. Czyli jeszcze raz: bufor, flawonoid, katalaza, mieszam i start. Mam widmo, za minutę kolejne i tak przez jakieś 2 godziny. No może krócej jeśli zobaczę, że dalsze pomiary nie mają żadnego sensu. Po 2 godzinach widzę, że mój enzym się zmienił, już nie jest tym samym aktywnym stworzonkiem. Nowe pasmo, które wybudowało się przy 435 nm, świadczy o przekształceniu natywnej formy enzymu w nieaktywny związek II. Dziś, po wnikliwym przeglądzie literatury i przeprowadzeniu znacznie dłuższego eksperymentu, wiem, że jest to proces odwracalny, że enzym po kilku godzinach powraca do swojej aktywnej formy – co jest bardzo dobrą wiadomością. Dlaczego? Nieaktywna katalaza nie rozkłada nadtlenku wodoru albo robi to w bardzo ograniczonym zakresie, przez co gromadzi się on w naszym organizmie i atakuje napotkane biocząsteczki.

I tak mijają kolejne dni analiz, każdy jest inny, każdego dnia badam inny związek, inne stężenie, inny układ, w końcu pogoda funduje mi zróżnicowane warunki środowiskowe. Porównuję, analizuję, wyciągam wnioski, opracowuję wyniki graficznie, drukuję i pieczołowicie wklejam do całkiem już pokaźnego zeszytu laboratoryjnego.

Dwa końce kija

Cała ta zabawa z flawonoidami jest naprawdę ważna. Otrzymane przeze mnie wyniki rzucają nowe światło na dotychczasowe myślenie o flawonoidach, fantastycznych związkach, które obronią nas przed wolnymi rodnikami. Flawonoidy mają dwie twarze, dwa zupełnie inne oblicza, które w zależności od stanu naszego zdrowia chcemy oglądać lub nie. Już w XV wieku Paracelsus mawiał, że „wszystko jest trucizną i nic nią nie jest, wszystko zależy jedynie od dawki”. Dodałabym tylko, że także od sytuacji. Nadmierna suplementacja tak obecnie popularnymi w internetowym świecie preparatami flawonoidowymi, bez nadzoru lekarza, może okazać się naprawdę niebezpieczna dla prawidłowego funkcjonowania naszego organizmu. Z jednej strony flawonoidy wyłapują atakujące nasz organizm wolne rodniki, z drugiej hamują aktywność katalazy (a niewykluczone, że także pozostałych enzymów detoksykacyjnych), paradoksalnie przyczyniając się w ten sposób do nadprodukcji reaktywnych form tlenu. Każdy kij ma dwa końce, także peroksydacyjny charakter flawonoidów może być pożądany. Dotyczy to jednak stanów chorobowych, w których wzmożona apoptoza (programowana śmierć) komórek np. nowotworowych, związana z nadprodukcją nadtlenku wodoru, jest pożądana. Najnowsze doniesienia naukowe wspominają także o możliwości wzmożonej ekspresji genów kodujących enzymy II fazy detoksykacji, co także jest zjawiskiem korzystnym.

Jak widać, wiele badań jeszcze przede mną. Ale to już zupełnie inna historia…