Wraz z pierwszymi promieniami wiosennego słońca zboże budzi się z zimowego snu. Uśpione do tej pory rośliny przyśpieszają swój metabolizm, by nagle wystrzelić ku górze, uczestnicząc w corocznym wyścigu życia, którego stawką jest osiągnięcie dojrzałości i wydanie potomstwa. W zaledwie kilkanaście tygodni zboże wyda plon, a ziarno w różnej postaci trafi na nasze talerze, będąc niemal codziennym składnikiem diety człowieka. W tej sielance czai się jednak wróg, z którym każdego roku prowadzimy niekończącą się batalię.

Zboża, grzyby i pestycydy

Zboża i produkty zbożowe to ważny składnik codziennej diety. Co ciekawe, pszenica, jęczmień, żyto i owies to nic innego, jak trawy poddane przez naszych przodków procesowi selekcji. W ciągu tysięcy lat świadomej hodowli ziarniaki stały się większe, a plon uzyskiwany z jednego pola mógł wyżywić coraz więcej ludzi. Wraz z rozwojem gospodarki zboża stały się przedmiotem handlu, a ukierunkowana hodowla – źródłem setek odmian, które w zależności od przeznaczenia charakteryzują się różnymi cechami. Najważniejszym celem hodowli jest uzyskanie jak najwyższego plonu, ale jednocześnie czynione są starania w kierunku selekcji takich odmian, które wykazują odporność na choroby, które wpływają negatywnie na plon oraz jego jakość.

Niestety, pomimo podejmowanych prób, nie udało się do tej pory trwale uodpornić zbóż na choroby powodowane przez grzyby. Wprawdzie uzyskiwano i nadal uzyskuje się odmiany posiadające pewien stopień odporności, najczęściej jednak nie jest ona kompleksowa i dotyczy jednego lub kilku gatunków grzybów. Tymczasem mikroorganizmy, ze względu na swoją zmienność i zdolność do adaptacji, szybko odnajdują się w nowych warunkach. Na starych i niegdyś odpornych odmianach zbóż widać dziś objawy charakterystyczne dla porażenia przez patogeny grzybowe. Proces ten można porównać do pojawiania się bakterii odpornych na antybiotyki, które to związki kiedyś siały spustoszenie w ich szeregach. Mikroorganizmy doskonale radzą sobie zarówno w zmiennych warunkach środowiska, jak i z pomysłowością człowieka.

Najskuteczniejszym orężem stosowanym do ochrony zbóż przed grzybami są środki ochrony roślin zwane pestycydami. Pierwszymi pestycydami były naturalne substancje, wobec których patogeny zbóż wykazywały wrażliwość, np. napary z tytoniu. Wkrótce pojawiły się również pierwsze pestycydy syntetyczne. Ze względu na fakt, iż substancje te nie występowały wcześniej w środowisku, zdarzało się, że wchodziły w interakcje, których w laboratorium nie dało się przewidzieć. Za przykład niech posłuży słynny dichlorodifenylotrichloroetan (DDT), który spustoszył populację ptaków, najprawdopodobniej hamując wychwytywanie wapnia z krwi, który to wapń następnie miał być wbudowywany w skorupkę jaj.

Ponadto warto wspomnieć o tym, iż środki ochrony roślin nie są selektywne. Zniszczenie populacji niepożądanego mikroorganizmu zwykle niesie za sobą również zniszczenie populacji innych mikroorganizmów, niekoniecznie szkodliwych. Problemy zaczynają się również wtedy, gdy substancja aktywna dostanie się do zbiorników wodnych. Ból głowy producentów pestycydów powodują również podejrzenia dotyczące wpływu tych substancji na występowanie tzw. zespołu masowego ginięcia pszczoły miodnej (ang. Colony Collapse Disorder). Populacja tych pożytecznych owadów regularnie się kurczy.

Żeby minimalizować wpływ środków ochrony roślin na człowieka i środowisko, stosuje się prewencję i karencję. Okres prewencji informuje o tym, ile czasu musi upłynąć, żeby substancja aktywna uległa rozpadowi, a karencja to czas, po którym chronione danym pestycydem rośliny nadają się do spożycia. W praktyce stosowanie się do wszystkich wymogów rzeczywiście ogranicza niebezpieczeństwo związane z pestycydami. Jednakże poziom zagrożenia nigdy nie spada do zera. W tym momencie do gry może włączyć się biotechnologia.

Identyfikacja patogenów

To był jeden z tych dni, kiedy zima, powoli ustępując miejsca wiośnie, odsłaniała dawno zapomniane kolory i kształty. Szary krajobraz za oknem mojego uczelnianego pokoju powoli odzyskiwał cieplejszy odcień, a skąpane w promieniach słońca płaty śniegu oddawały kropla po kropli to, co zagarnęła zima. Tego dnia w zaciszu uczelni odbyła się owocna dyskusja na temat możliwości określenia obecności grzybów na polu wczesną wiosną, tak aby dało się na tej podstawie zaplanować zastosowanie środków ochrony roślin. Mając wiedzę na temat gatunków grzybów występujących na polu, można dobrać odpowiednią dawkę środka, właściwe substancje aktywne itd. W ten sposób można by precyzyjnie ograniczyć populację określonych gatunków grzybów, minimalizując jednocześnie negatywny wpływ środków ochrony roślin na środowisko.

Wiosna zbliżała się dużymi krokami, wieszcząc początek okresu wegetacyjnego zbóż. Wraz z nim za kilka tygodni powinny również zostać zastosowane pierwsze pestycydy, tak by powstrzymać rozwój patogenów. Tak kompleksowe podejście do diagnostyki molekularnej oraz krótki czas, jaki pozostał mi na skompletowanie warsztatu badawczego, spowodowały, że miałem duże wątpliwości. Pomimo tego postanowiłem spróbować. Pomyślałem, że gdyby udało się zaadaptować całe spektrum metod do identyfikacji patogenów, byłoby to znakomite narzędzie pozwalające na kierunkowe stosowanie środków ochrony roślin.

Łańcuchowa reakcja polimerazy (w skrócie PCR) to metoda szeroko wykorzystywana w biologii molekularnej. Umożliwia ona powielenie dowolnej nici DNA. Żeby było to możliwe, musimy dysponować czymś, co pokaże enzymowi stosowanemu w reakcji PCR fragment, który należy powielać. Tym czymś są tzw. oligonukleotydy, czyli krótkie odcinki DNA pasujące do określonego miejsca w genomie. Dzięki oligonukleotydom powielany jest tylko określony fragment DNA. Co ciekawe, ponieważ nie zdarza się, żeby dany oligonukleotyd pasował do innego odcinka DNA, np. w innym organizmie, możemy tak zaplanować PCR, że umożliwi nam bezbłędną identyfikację. W praktyce identyfikacja do gatunku za pomocą reakcji PCR jest stosowana już od kilkudziesięciu lat i nie ma w tym nic nadzwyczajnego. Wciąż jednak w fitopatologii metoda ta rzadko wychodzi poza laboratoria, a jej stosowanie w praktyce ogranicza się najczęściej do opracowań statystycznych dotyczących występowania szkodników roślin w danym rejonie lub kraju. A szkoda, bo ma ogromny potencjał praktyczny.

Metody identyfikacji dzięki reakcji PCR przeprowadza się w kilku krokach. Dodatkowo w celu weryfikacji zaprojektowanej metody najczęściej trzeba po prostu zebrać odpowiednio dużo przedstawicieli danego gatunku oraz dużo przedstawicieli gatunków podobnych. Najpierw wykonuje się tzw. RAPD-PCR, który ma na celu znalezienie różnic między gatunkiem przez nas wybranym a pozostałymi. W praktyce oznacza to przeszukiwanie genomu za pomocą pojedynczej, krótkiej pary starterów, niejednokrotnie poprzez wykonywanie setek reakcji PCR. Potem prążek różnicujący klonuje się, sekwencjonuje, projektuje startery, a następnie testuje je na przedstawicielach wybranego gatunku oraz przedstawicielach gatunków podobnych. Jeśli zaprojektowane oligonukleotydy nie dają produktów PCR nigdzie indziej tylko w wyniku powielania DNA gatunku, który nas interesuje, to odnieśliśmy sukces. Wszystko działa, ale pracochłonność tej metody jest naprawdę duża.

Publikacji dotyczących identyfikacji grzybów – szkodników zbóż za pomocą reakcji PCR jest sporo, choć w dostępnej literaturze nie spotkałem się z pracami naukowymi, w których do problemu grzybów atakujących zboża podchodzono by w sposób kompleksowy. Zwykle jeden badacz interesuje się tylko jednym gatunkiem lub rodzajem i rozwija metody związane z identyfikacją tylko tego gatunku grzyba.

Z laboratorium na pola

DNA to cząsteczka, która służy organizmom żywym jako nośnik informacji genetycznej. Instrukcje te są zakodowane za pomocą ułożonych w odpowiedniej kolejności nukleotydów. Całość DNA danego organizmu nazywana jest genomem. Fragmenty genomów poszczególnych organizmów są sekwencjonowane, (czyli poznawana jest kolejność zawartych w nich nukleotydów) przez biologów molekularnych już od jakiegoś czasu. Uzyskane sekwencje DNA znajdują się w międzynarodowej bazie danych zwanej NCBI GenBank. Zasoby tej bazy podwajają się co każde 10 miesięcy. W 2005 roku znajdowało się w niej już ponad 100 miliardów nukleotydów.

Pierwszym krokiem w moich badaniach było wytypowanie tych gatunków grzybów, które powodują największe straty w zbożach. Byłem pewien, że do wszystkich tych szkodników opracowano już metody identyfikacji. Okazało się, że nie. Wiele gatunków wciąż pozostawało niezbadanych pod tym względem. Przeszukanie bazy NCBI GenBank ujawniło, że jest tam dużo genów pochodzących z grzybów, których identyfikacja wciąż nie jest prowadzona. Posłużyłem się nimi w taki sposób, jakby były wynikiem mojego przeszukiwania genomów z użyciem metody RAPD-PCR. W każdym gatunku wyszukałem geny, które powtarzają się najczęściej, a w ich obrębie wytypowałem obszary najbardziej konserwatywne, zaprojektowałem oligonukleotydy, a następnie przetestowałem całe zasoby bazy pod kątem istnienia innych gatunków, których DNA mogłoby być błędnie powielane z moimi oligonukleotydami. Jednym słowem – całą mozolną pracę laboratoryjną zastąpiłem analizami komputerowymi. Co ciekawe, oligonukleotydy sprawdziłem tak naprawdę na znacznie większej liczbie izolatów grzybów, niż jakikolwiek badacz posługujący się klasyczną metodą i pracujący z żywymi mikroorganizmami.

Wkrótce, razem ze studentami z uczelnianego koła naukowego, rozpoczęliśmy pracę w laboratorium. W napięciu czekaliśmy na żele ukazujące wynik powielania za pomocą reakcji PCR. Odetchnąłem z ulgą, kiedy zobaczyliśmy prążki. W ciągu następnego tygodnia również sekwencjonowanie DNA potwierdziło, że powielany jest dokładnie ten fragment co trzeba, charakterystyczny dla tego organizmu, do którego był zaprojektowany.

Oznaczanie całego spektrum patogenów zbóż przed pierwszym zabiegiem środkami ochrony roślin okazało się owocne. Co ciekawe, wyniki oznaczania pozostawały w zgodzie z tym, jakie zabiegi na jesieni wykonywano na danym polu, potwierdzając niejako skuteczność tych środków. Bazując na oznaczeniach wykonanych w uczelnianym laboratorium dobrane zostały odpowiednie pestycydy i ich dawki. Tam, gdzie wykazano obecność niewielu gatunków grzybów, zabiegi wykonano najniższymi dawkami.

W planach jest również opracowanie całego spektrum oligonukleotydów do ilościowego oznaczania grzybów. Tutaj jednak poziom trudności będzie znacznie wyższy, a czas potrzebny do uzyskania „produktu finalnego” można liczyć w latach. Historia tych badań dopiero się rozpoczyna.

Mam nadzieję, że chociaż trochę zainteresowałem Czytelników zagadnieniami związanymi z biologią molekularną. Mam również nadzieję, że uda mi się w ten sposób zachęcić innych badaczy do rozwijania metod identyfikacji patogenów zbóż, dzięki czemu środki ochrony roślin stosowane będą tylko wtedy, kiedy będzie to naprawdę uzasadnione i potrzebne. Nieprędko znajdziemy alternatywę dla pestycydów, dlatego ważne jest, aby już dzisiaj rozsądne z nich korzystanie zapobiegało akumulacji niebezpiecznych substancji w środowisku oraz w organizmach ludzi i zwierząt.