Natura wszechrzeczy
lubi się ukrywać

Heraklit z Efezu

Gdy myślimy o bakteriach, przed oczami przesuwają się nam obrazy różnokolorowych pałeczek, krętków, form kulistych, a nawet postaci z serialu Było sobie życie . Komórki bakteryjne często przedstawiane są w atlasach czy podręcznikach w postaci gron, łańcuszków oraz innych skupisk. Takimi widzieli je pierwsi mikrobiolodzy w okularach swoich mikroskopów i tak też o nich myśleli.

Przełom przyszedł w roku 1940, gdy jeden z badaczy z zespołu prof. Heukelekiana, po wykonaniu eksperymentu, wylał zawiesinę bakteryjną z probówki i zobaczył, że pozostał w niej osad. Ten fakt nie był niczym niezwykłym – hodując bakterie w probówkach, nagminnie obserwowano, że po jakimś czasie na ich ściankach osadza się trudny do usunięcia bakteryjny nalot. Standardową procedurą w takim wypadku było oddanie probówki do czyszczenia i jałowienia. Ale wzmiankowany badacz zadał sobie pytanie: „A właściwie dlaczego bakterie osadzają się na ściankach probówki?”. Tak postawiony problem okazał się być dla mikrobiologii i medycyny tym, czym dla fizyki i astronomii okazało się proste pytanie Newtona: „A właściwie dlaczego jabłko spadło mi na głowę?”.

I tu czas wytłumaczyć się z tytułu niniejszej pracy. Jeśli komuś zdarzy się potknąć o słonia, wszyscy się dziwią, no bo przecież jak można nie zauważyć słonia! A jednak można. Badania wykazały bowiem, że bakterie tworzące osad są w stanie przeżyć w warunkach, które były zabójcze dla tych samych bakterii pływających w zawiesinie. W kolejnych latach zaobserwowano, że bakterie przylegające do powierzchni pokryte są grubą warstwą śluzu chroniącego je przed niesprzyjającymi czynnikami fizycznymi i chemicznymi, a także przed antybiotykami. Co więcej, odkryto, że otoczone zewnątrzkomórkowym śluzem bakterie tworzą skomplikowaną strukturę, przypominającą średniowieczne miasto, otoczone potężnym murem zewnątrzkomórkowych egzopolisacharydów i wyposażone w sieć irygacyjną oraz kanalizacyjną. Okazało się także, że osiadłe społeczności bakteryjne porozumiewają się za pomocą specyficznego, „chemicznego” języka, nazywanego systemem Quorum Sensing. Taką społeczność bakteryjną, osiadłą i otoczoną śluzem, zaczęto w latach 70. nazywać biofilmem. Obecnie uważa się, że 99,9 proc. całkowitej biomasy bakteryjnej na świecie występuje w formie biofilmu, a ponad 80 proc. wszystkich infekcji szpitalnych wywoływanych jest właśnie przez bakterie w tej formie organizacji przestrzennej. I jak można było tego nie zauważyć? Proszę Państwa, oto słoń! Ukłonił się i zatrąbił.

Barwiona studzienka

W roku 2010 rozpocząłem pracę doktorską dotyczącą wpływu antybiotyku makrolidowego, erytromycyny, na biofilm tworzony przez bakterie Klebsiella pneumoniae . Każdy mikrobiolog, słysząc, że makrolidy mogą działać hamująco na biofilm tworzony przez te bakterie, zapyta: „Jak to? Przecież od blisko 50 lat (czyli od czasu, gdy erytromycynę wprowadzono do lecznictwa) wiadomo, że antybiotyki z tej grupy nie działają na Enterobacteriacae (do których należy rodzaj Klebsiella ) oraz na pałeczki niefermentujące, takie jak Pseudomonas aeruginosa ”. Wszystko się zgadza, makrolidy nie zakłócają procesu syntezy kwasów nukleinowych i ścian komórkowych tych bakterii, nie działają więc w sposób „klasyczny”. Od pewnego czasu wiadomo jednak, że niektóre makrolidy w znaczący sposób upośledzają zjadliwość pałeczek P. aeruginosa – w tym hamują ich zdolność do tworzenia biofilmu. Co najistotniejsze, udowodniono to nie tylko w warunkach laboratoryjnych, ale także lecząc pacjentów cierpiących od zakażeń wywołanych przez te bakterie. Zagadką pozostaje natomiast dokładny mechanizm, za pomocą którego makrolidy wpływają na P. aeruginosa . Pewne poszlaki wskazują jednak na to, że antybiotyki te działają hamująco na wspomnianą już zdolność do komunikacji między bakteriami, czyli system Quorum Sensing. W każdym razie problem badawczy, z którym miałem się uporać, brzmiał: „Czy makrolidy mogą oddziaływać na biofilm tworzony przez Klebsiella pneumoniae , tak jak ma to miejsce w przypadku biofilmu Pseudomonas aeruginosa ?”.

Badania rozpocząłem od standardowego pomiaru wykorzystującego przykrą zdolność substancji nazywanej fioletem krystalicznym do trwałego barwienia niemal wszystkich rodzajów powierzchni organicznych. Zdolność ta jest przykra, ponieważ niezwykle często uzmysławia badaczom, jak bardzo „organiczne” są ich fartuchy, ręce czy uszy.

125 szczepów Klebsiella pneumoniae , wyizolowanych z ciężkich zakażeń szpitalnych, hodowałem w specjalnych studzienkach przez 24 godziny, czekając aż wytworzą biofilm (co sprawdzałem za pomocą mikroskopii elektronowej), a po upływie tego czasu dodawałem do studzienek fizjologiczne (takie jak osiągane w ciele pacjenta) stężenia erytromycyny. Następnie do studzienek wprowadzałem wspomniany już fiolet krystaliczny i określałem za pomocą spektrofotometru, jaka ilość barwnika została zaabsorbowana. Im więcej biomasy bakteryjnej było w studzienkach, tym wyższa była wartość mierzonej absorpcji. Okazało się, że erytromycyna nie zmniejsza ilości utworzonego biofilmu, oddziałuje natomiast hamująco na proces jego tworzenia w przypadku, gdy do studzienek wprowadzono jednocześnie antybiotyk oraz zawiesinę bakteryjną. Okazało się, że ta zależność jest dawkozależna. Hamująco na tworzenie biofilmu działały stężenia antybiotyku wynoszące 3-5 mg/L, ale już nie stężenia 1-2 mg/L.

Tworzenie więzi

Studzienki studzienkami, ale co w przypadku biofilmu formującego się na różnego rodzajach implantach stosowanych w medycynie? Do badań wybrałem biomateriały, na których Klebsiella pneumoniae szczególnie często tworzy biofilm w warunkach szpitalnych – cewniki moczowe i naczyniowe, rurki intubacyjne oraz siatki przepuklinowe. Początkowo sprawdziłem, czy badane przeze mnie szczepy są w stanie tworzyć biofilm na wyżej wzmiankowanych biomateriałach. Pomogli mi w tym doktoranci z pobliskiej politechniki, którzy zaznajomili mnie z zasadami obsługi mikroskopu laserowego 3D, dzięki czemu mogłem na własne oczy zobaczyć biofilm, i to w kolorze! Okazało się, że wszystkie badane szczepy czują się świetnie na biomateriałach, które zostały specjalnie zaprojektowane w ten sposób, by zmniejszyć prawdopodobieństwo zakażenia… W kolejnym etapie doświadczenia tworzący się biofilm poddałem działaniu makrolidu. Doprowadziło to do istotnej statystycznie redukcji liczby komórek tworzących tę strukturę w porównaniu z grupą kontrolną (taką, która nie była poddana działaniu antybiotyku).

Proces tworzenia się biofilmu obejmuje specyficzne stadia: bakterie najpierw pływają w zawiesinie, a następnie za pomocą specjalnych wypustek (adhezyn) wiążą się z podłożem. W kolejnym etapie komórki pokrywają się śluzem i tak tworzą dojrzały biofilm. Po pewnym czasie bakterie ze szczytowej warstwy dojrzałej struktury „tną” enzymatycznie śluz i uwalniając się w ten sposób, pływają, szukając kolejnego miejsca do zasiedlenia. Podczas badań wykorzystujących mikroskopię elektronową zaobserwowałem, że bakterie poddane działaniu erytromycyny wykazywały niską zdolność do wiązania się z podłożem. Podczas gdy bakterie w grupie kontrolnej już po dwóch godzinach inkubacji przylegały gęsto do powierzchni, w grupie badanej widać było rzadkie 4 grupki komórek rosnących to tu, to tam. Pomyślałem więc, że makrolid działać może na początkowy etap tworzenia biofilmu, czyli na adhezję.

W przypadku Klebsiella pneumoniae za adhezję odpowiedzialne są przede wszystkim dwa rodzaje adhezyn nazywanych fimbriami typu 1 oraz 3. Chcąc określić, czy istnieje zależność między rodzajem ufimbriowania bakterii a ich zdolnością do adhezji w obecności makrolidu, należało określić wpierw, który z rodzajów fimbrii obecny jest na każdym badanym szczepie bakteryjnym. W tym celu posłużyłem się metodą molekularną, pozwalającą na detekcję genów odpowiedzialnych za syntezę poszczególnych rodzajów fimbrii, nazywaną PCR (łańcuchową reakcją polimerazy). Porównując uzyskane wyniki z danymi z wcześniejszych pomiarów, ze smutkiem musiałem stwierdzić, że żadnej istotnej statystycznie korelacji nie było…

Bakterie w rurce

Chcąc dać jeszcze jedną szansę koncepcji oddziaływania makrolidu poprzez hamowanie adhezji, przekopałem się przez literaturę naukową i zmieniłem model doświadczalny. Wykonałem mianowicie badania w tak zwanych warunkach „przepływowych”, wykorzystując do tego celu pompę perystaltyczną. Pompa ta przetaczała zawiesinę bakterii oraz makrolidu przez rurkę cewnika moczowego, przy czym bakterie, które nie zdążyły związać się z jego powierzchnią, usuwane były do naczynia zbiorczego. Po upływie czasu doświadczenia bakterie, które osiadły na cewniku, odrywałem z niego za pomocą nisko stężonego detergentu i wysiewałem na płytki zawierające stałe podłoże wzrostowe. Następnie zliczałem ilość kolonii bakteryjnych, które wyrastały na tym podłożu. Całe doświadczenie miało na celu stworzenie warunków, w których fimbrie bakteryjne mogłyby „wykazać” swoją przydatność.

Okazało się, że bakterie posiadające fimbrie typu 1 oraz 3, adherowały w wyższej liczbie do cewnika niż bakterie, które posiadały tylko jeden rodzaj fimbrii (1 albo 3). Po drugie, okazało się, że bakterie posiadające tylko fimbrie typu 1 gorzej przyłączały się do cewnika w obecności makrolidu w porównaniu z tymi samymi bakteriami nie poddanymi działaniu antybiotyku. Bakterie mające tylko fimbrie typu 3 w obecności makrolidu także słabiej adherowały do powierzchni cewnika, jakkolwiek obserwowany efekt był słabszy niż w przypadku bakterii posiadających fimbrie „jedynki”. Uzyskane wyniki sugerują, że erytromycyna hamuje rozwój biofilmu Klebsiella pneumoniae poprzez interakcję z adhezynami tych bakterii.

Myślicie, że już po sprawie? Nic bardziej mylnego. To prawda, że wykonane badania potwierdziły hamujący wpływ erytromycyny na tworzenie biofilmu Klebsiella pneumoniae . Biorąc pod uwagę zagrożenia, jakie dla pacjentów niosą infekcje związane z obecnością biofilmu, uzyskane dane mogą okazać się istotne klinicznie.

Jednak to, czy na powierzchni komórki pojawią się fimbrie, zależy w dużej mierze od systemu Quorum Sensing. Może więc obserwowana zależność jest wynikiem hamowania przez erytromycynę nie fimbrii, ale cząsteczek Quorum Sensing? A może receptorów tych cząsteczek? Badania, które obecnie prowadzę, obejmują wykorzystanie narzędzi bioinformatycznych oraz spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Mam nadzieję, że wykorzystanie tych zaawansowanych technologicznie metod pozwoli uzyskać odpowiedź na dręczące mnie pytania. Jednak czasem, patrząc na probówki wypełnione zawiesiną bakteryjną, mam wrażenie, że patrzę na całe stado słoni raźnie biegających po niezbadanych jeszcze lądach…

Zapowiedzi konferencji naukowych

9 lutego. Poznań. Ogólnopolska konferencja logopedyczna Rozumiem – mówię – poznaję świat . Organizator: Wyższa Szkoła Edukacji Integracyjnej i Interkulturowej w Poznaniu. Termin zgłoszeń – do 18 stycznia 2013 . Więcej na: http://www.wseiii.pl/index.php?mact=News,cntnt01,detail,0&cntnt01articleid=112&cntnt01origid=15&cntnt01detailtemplate=Details&cntnt01returnid=60.

4 marca. Poznań. Budżet zadaniowy – doświadczenia, kontrowersje i wyzwania. Konferencja naukowa z okazji Jubileuszu 85-lecia urodzin Profesorów Ryszarda Domańskiego i Bohdana Gruchmana, pod patronatem JM Rektora Uniwersytetu Ekonomicznego w Poznaniu prof. dr hab. Mariana Goryni. Organizatorzy: Katedra Teorii Pieniądza i Polityki Pieniężnej UEP, Katedra Teorii i Historii Ekonomii UEP, Biuro Analiz Sejmowych Kancelarii Sejmu i Najwyższa Izba Kontroli. Kontakt: e-mail: konferencja@budzet-zadaniowy-konferencja.pl. Więcej na: http://budzet-zadaniowy-konferencja.pl/.

21-22 marca. Lublin. Interdyscyplinarna ogólnopolska konferencja naukowa Konspekty wolności. Przewodniczący komitetu organizacyjnego: dr hab. Leszek Kopciuch. Organizatorzy: Lubelskie Towarzystwo Naukowe, Instytut Filozofii Uniwersytetu Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie. Termin zgłoszeń – do 31 stycznia 2013 . Więcej na: http://kontekstywolnosci.wordpress.com.

12-13 kwietnia. Warszawa. 3. Międzynarodowy Kongres Medyczny Kobieta i mężczyzna. Zdrowie reprodukcyjne i seksualne. Komitet Naukowy Kongresu: prof. Włodzimierz Baranowski (Kierownik Kliniki Ginekologii i Ginekologii Onkologicznej Centralnego Szpitala Klinicznego MON Wojskowego Instytutu Medycznego w Warszawie), prof. Zbigniew Lew-Starowicz (Kierownik Zakładu Seksuologii Medycznej i Psychoterapii Centrum Medycznego Kształcenia Podyplomowego w Warszawie) i prof. Piotr Radziszewski (Kierownik Katedry i Kliniki Urologii Ogólnej, Onkologicznej i Czynnościowej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego). Kontakt: Omni Consumer Info Sp. z o.o., tel.: +48 (22)279-49-02/03/04/05, fax: +48 (22) 279-49-10, e-mail: kongres@ocinfo.pl, www.kobietaimezczyzna.info, http://www.facebook.com/kongresymedycznekobietaimezczyzna.

cd. na str.

cd. ze str.

15-17 maja. Gdańsk. Międzynarodowa konferencja naukowa Ekonomia, kultura, wartości. U źródeł nauk społecznych oraz nauk o kulturze. Konferencja zorganizowana w 150. rocznicę urodzin Heinricha Rickerta oraz dwudziestolecia powstania Wydziału Zarządzania i Ekonomii Politechniki Gdańskiej. Organizatorzy: Wydział Zarządzania i Ekonomii Politechniki Gdańskiej, Instytut Filozofii Uniwersytetu Śląskiego oraz Instytut Filozofii UMK w Toruniu. Termin zgłoszeń – do 4 marca 2013 . Kontakt: konferencja-rickert@zie.gda.pl. Więcej na: http://www.zie.pg.gda.pl/konferencja-rickert.

20-24 maja. Sopot. 2nd Nano-IBCT Conference (Nano-scale insights into lon beam cancer therapy). Organizator: Wydział Fizyki Technicznej i Matematyki Stosowanej Politechniki Gdańskiej. Kontakt: nano-ibct2013@mif.pg.gda.pl. Więcej na: http://nano-ibct2013.mif.pg.gda.pl.

25-26 maja. Wrocław. Ways to protolanguage 3. Organizatorzy: Wyższa Szkoła Filologiczna we Wrocławiu, Katedra Filologii Angielskiej oraz CLES UMK w Toruniu, Komisja Nauk Filologicznych PAN Oddział we Wrocławiu. Kontakt: Anna Zasłona, e-mail: a.zaslona@wsf.edu.pl, tel.: (71) 395-84-73. Więcej na: http://protolanguage2013.wsf.edu.pl.

16-19 września. Kraków. 6th Kurt Schwabe Symposium – Surface analysis and material engineering in corrosion science and electrochemical technologies . Organizator: Katedra Chemii i Korozji Metali WO Akademii Górniczo-Hutniczej, Wydział Chemii Uniwersytetu Warszawskiego. Kontakt: prof. dr hab. Jacek Banaś, e-mail: jbs@agh.edu.pl. Więcej na: http://home.agh.edu.pl/~schwabe/.

22-24 września. Zakopane. Jubilee XX International Symposium on Application of Systems Theory. Organizator: Katedra Systemów Wytwarzania WIMiR AGH. Kontakt: dr inż. Michał Bembenek, e-mail: bembenek@agh.edu.pl. Więcej na: http://systemy.imir.agh.edu.pl.

16-18 października. Gdańsk. 10. Jubileuszowa konferencja Shell Structures: Theory and Applications 2013. Organizator: Katedra Mechaniki Budowli i Mostów Wydziału Inżynierii Lądowej i Środowiska Politechniki Gdańskiej. Kontakt: e-mail: ssta@wilis.pg.gda.pl. Więcej na: http://www.ssta.pg.gda.pl.

8-10 listopada. Toruń. 1st International Conference Trends in interdisciplinary studies. Organizatorzy: stowarzyszenie naukowe Ośrodek Badań Filozoficznych oraz Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu. Tematyką pierwszej edycji konferencji będą pozaneuronalne aspekty poznania; wykładowcy specjalni: prof. David Kirsh (University of California) i prof. Anthony Chemero (University of Cincinnati). Termin nadsyłania abstraktów – do 14 lipca 2013 na http://avant.edu.pl/trends. Pozostałe informacje na stronie internetowej konferencji: http://avant.edu.pl/trends.