Pierwszym rektorem Akademii Krakowskiej został Stanisław ze Skalbmierza (na rok akademicki, co było powszechnym zwyczajem). Zapisało się na zajęcia do matrykuły 205 scholarów. Mistrzów (magistrów) doliczono się 40 (1407). Działały już dwa collegia: teologów i artystów oraz prawa (kościelnego, czyli dekretów, bo do cywilnego – leges nie znaleziono mistrza). Jak ustalił Krzysztof Ożóg (2004), w latach 1400−1434 do matrykuły wpisało się ogółem 4450 scholarów – licznie z Węgier, Śląska i Mazowsza, a nie tylko z Małopolski. W połowie XV w. liczba scholarów w uczelni sięga 300, a pod koniec tego wieku – 500. Nie zawsze uzyskiwano stopnie naukowe. Kazimierz Morawski („Historya Uniwersytetu Jagiellońskiego”, 1900) ocenia, że w XV wieku „tylko 1/4 opuszczała studia z tytułem bakałarza, może 1/20 ze stopniem magistra. Bo i życie i wymogi życia bynajmniej do tego nie pchały. Średnie wieki nie wiązały karier z wykształceniem uniwersyteckim, nie znały karier i powołań zależnych od stopnia akademickiego”. Decydował o tym scholastyczny wzorzec studiowania – myśl „ginęła w tej superfluitas maditationis (...) słowa spadały w całych potokach z katedr (...). Szczególnie studia fakultetu artystycznego tchną tym oderwaniem od życia”. Dysputy były wtedy „najistotniejszym wyrazem nauki”.

Collegium Medicum uformowało się dopiero w połowie XV w. – pojawiały się wśród mistrzów tego fakultetu także osoby świeckie. Ogółem stan akademicki był traktowany jako część stanu duchownego i zakonnego, niemal wszyscy mistrzowie mieli niższe święcenia kapłańskie. Wsparcie ze strony fundatorów po roku 1434 słabło. Żywioł mieszczański, w części niemieckiego pochodzenia, był wypierany wśród fundatorów i scholarów przez szlachtę. Sprzyjało temu powołanie Collegium Minus (1449), gdzie nauczano na poziomie gimnazjalnym (w ramach fakultetu artes liberales) – matematyki, astronomii i klasycznej łaciny. Wyrazem instytucjonalizacji było uformowanie się w roku 1464 senatu. Fakultet praw, jak ocenił Morawski, „chromał” – dopiero w 1533 erygowana została nowa kolegiatura w celu nauki prawa rzymskiego (Corpus Iuris Civilis). By wzmocnić fakultet lekarski, który dopiero w roku 1505 uzyskał drugą katedrę, wprowadzono (1610) zasadę pro loco respondere: każdy lekarz praktykujący w Polsce musiał uzyskać zatwierdzenie od Akademii Krakowskiej.

Epokę humanizmu zapoczątkował przybyły do Polski w roku 1469 Filip Buonaccorsi−Kallimach. Znalazł schronienie u lwowskiego arcybiskupa, Grzegorza z Sanoka, a w 1472 wpisał się do matrykuły Akademii Krakowskiej i podjął nauczanie dzieci króla Kazimierza Jagiellończyka. Przełom humanistyczny wspomogło upowszechnianie drukowanych ksiąg – w Krakowie w 1500 roku Jan Haller uruchamia pierwszą drukarnię. Powszechnym zwyczajem staje się przywożenie z zagranicznych peregrynacji książek. Upowszechnia się epistolografia – powstają tą drogą collegia invisibile, łączące uczonych z różnych uniwersytetów. Krzewicielami humanizmu w Akademii Krakowskiej stają się extranei – nadliczbowi nauczyciele fakultetu artes liberales. Sięgają po dzieła klasyków literatury, cenią dobrą wymowę przyjmując tytuł poeta. Przystąpiono, jak pisze Morawski, „do inwentaryzacji dotychczasowej nauki, do spisywania podręczników, które tę naukę w przystępnej miały podać formie”. Pojawia się w 1491 roku wśród scholarów Mikołaj Kopernik. Katedra Historiografii została uposażona i odnowiona w 1621 przez Sebastiana Pertycego – jej plan zarysował już w 1480 roku Jan Długosz, w zakończeniu „Roczników”.

Po humanistycznym wzlocie, około roku 1525, spada liczba scholarów do około 200. Pojawiają się wśród nich coraz liczniej biedniejsi, bogatszych interesują peregrynacje zagraniczne. Przez to biednieje Akademia Krakowska. Daleko do modernizacji metod. Jak ustalił Morawski, na fakultecie artes liberales „panowała opinia, że każdy magister jest uzdolnionym do wykładu każdego przedmiotu”, o przydziale decydowało losowanie: „lectio, exercium, disputatio – oto trzy drogi, którymi płynęła nauka i spływała na scholarów (...). Wykład opierał się zawsze na księdze, uznanej za kanoniczną. Nauczyciel musiał ją rozdziałami czytać i objaśniać, błąkać się po lesie komentarzy”. W XVI wieku, jak pisze Henryk Barycz („Historja Uniwersytetu Jagiellońskiego w epoce humanizmu”, 1935), organizacja, programy i podręczniki pozostały w Akademii Krakowskiej bez zmian. Wprowadzono natomiast nauczanie klasycznej łaciny, greki i hebrajskiego (tu do studiów biblijnych). Wystąpienie Marcina Lutra (1517) wywołało nie tylko kryzys Kościoła, ale i zburzyło dotychczasową jedność nauki. Pojawił się w Krakowie odpływ nacji niemieckiej, śląskiej, skandynawskiej, a z czasem i pomorskiej. Od roku 1523 pojawiają się królewskie zakazy handlu książkami różnowierczymi. Zakony kierują swoich braci na studia ściśle zakonne. Spada liczba darowizn i fundacji. Jako konsekwencja występuje lekceważenie obowiązków – po stronie scholarów i mistrzów, spada liczba promocji. Jak ocenia Barycz, „Wszechnica Krakowska przybiera w miarę lat inną fizjognomię: z uczelni par excellance międzynarodowej (...) staje się szkołą krajową, a w niedalekiej perspektywie zakładem plebejsko−mieszczańskim”.