Większość z nas boi się kleszczy i można to racjonalnie wytłumaczyć. Są małe, nieprzyjemne, mają osiem nóg i piją krew. W dodatku nieproszone mogą nam pozostawić „drobny upominek” w postaci patogennych bakterii, wirusów, pierwotniaków. O boreliozie i kleszczowym zapaleniu mózgu wiemy dużo, gdyż są to zawsze bardzo chętnie poruszane tematy wiosenno−letnich programów telewizyjnych oraz artykułów prasowych. Doskonale wiemy, że po wizycie w lesie należy się dobrze obejrzeć w poszukiwaniu małych intruzów, że stosowanie repelentów pomoże odstraszyć uciążliwych krwiopijców, że należy się szczepić. Czy to już wszystko? Warto przyjrzeć się im dokładniej.

Kleszcz jaki jest, każdy widzi, ale nie wszyscy są świadomi tego, że te małe pajęczaki, których wielkość waha się od ułamków milimetra (larwy) do nawet 2 centymetrów (najedzone samice), ustanowiły kilka rekordów w mikroświecie bezkręgowców. Jak na tak małe stawonogi żyją one dość długo – nawet kilkanaście lat. Co ciekawe, żyją tym dłużej, im dłuższe są okresy diapauzy (kiedy kleszcz nie pobiera pokarmu), które mogą trwać nawet kilka lat. Ponadto wydaje się, że to jedne z największych obżartuchów – po obfitym posiłku powiększają swoją masę nawet kilkadziesiąt razy.

Gatunkiem powszechnie występującym w Polsce jest kleszcz pospolity Ixodes ricinus, częsty mieszkaniec lasów, miejskich parków i ogródków działkowych. Larwy, nimfy i samice kleszcza pospolitego (przedstawione na zdjęciu 1), aktywnie poszukują potencjalnego żywiciela za pomocą sensilli czuciowych zlokalizowanych na stopach pierwszej z czterech par odnóży. Wrażliwe na ciepło opadają na swoją ofiarę, ale to dopiero początek długiej drogi do krwawej uczty. Znalezienie odpowiedniego miejsca do ugryzienia – aby było blisko naczyń krwionośnych, a jednocześnie daleko od dzioba, zębów lub pazurów żywiciela – to nie lada wyzwanie dla małego pajęczaka. A jednak często to on wychodzi z tej próby zwycięsko, pozostawiając po sobie trudny do usunięcia ślad.

Malaria północy

Choroby odkleszczowe to narastający problem epidemiologiczny na całym świecie. Od kilku lat notuje się wyraźny wzrost zachorowań zarówno ludzi, jak i zwierząt. Pasożyty wywołujące te choroby przekraczają barierę gatunkową, wspomagane przez krwiopijnych stawonogów krążą w środowisku naturalnym i stanowią realne zagrożenie. Różnorodność gatunkowa i genetyczna, szybkie tempo mutacji sprzyjają adaptacji do nowego, podatnego na zakażenie żywiciela, którym jest człowiek. Dlatego kleszcze, a głównie to, co przenoszą, jest obiektem zainteresowania współczesnych naukowców.

Tematem moich badań jest Babesia microti (zdjęcie 2), pasożyt krwi, czynnik etiologiczny choroby transmisyjnej, nie tak znanej jak borelioza, ale nie mniej groźnej dla ludzi. Pierwotniaki te zostały rozpoznane już w końcu XIX wieku jako pierwsze pasożyty kręgowców przenoszone przez krwiopijne stawonogi. Pierwsze podejrzenia zakażenia ludzi przez Babesia spp. pojawiły się już w 1908, jednak dopiero w roku 1957 udokumentowano pierwszy przypadek ludzkiej babesiozy u jugosłowiańskiego krawca. Babesia spp. stanowi obecnie istotne zagrożenie dla osób z niską odpornością (chorzy na AIDS, pacjenci po usunięciu śledziony, przyjmujący leki immunosupresyjne, ludzie w podeszłym wieku). U osób zdrowych zakażenie przebiega bezobjawowo. Problem pojawia się wtedy, gdy takie pozornie zdrowe osoby zostają dawcami krwi. Podanie krwi zakażonej przez Babesia spp. pacjentom po zabiegach np. transplantacji może mieć tragiczny skutek. Zarówno preparaty krwiopochodne, jak i krew gromadzona w bankach krwi, nie są standardowo badane w kierunku obecności pierwotniaków z rodzaju Babesia. Niestety, stosunkowo niewielu lekarzy i pracowników laboratoriów diagnostycznych słyszało o tej chorobie.

Dotychczas na całym świecie, również w Europie, odnotowano kilkaset przypadków babesiozy. W Polsce opisano tylko jeden przypadek tej choroby. Wydaje się jednak, że wynika to raczej z niedoskonałej diagnostyki niż z rzeczywistego braku transmisji i zakażenia kleszczy. Mało specyficzne objawy kliniczne (gorączka, dreszcze, zmęczenie, anemia hemolityczna) utrudniają prawidłowe rozpoznanie, a tym samym określenie dokładnej liczby zachorowań. Ze względu na podobieństwo objawów oraz obraz pierwotniaka w erytrocytach, babesiozę określa się również mianem „malarii Północy”.

Na kocyku

Badania dotyczące występowania mikropasożytów w środowisku naturalnym są wieloetapowe i nie pozwalają zamknąć się w laboratorium. Pierwszy etap to spacer po lesie w letnie poranki i popołudnia, ostatni – poznanie sekwencji nukleotydowej DNA zamkniętego w probówce. Ale zacznijmy od początku.

Kleszcze zbierane są na terenie Mazurskiego Parku Krajobrazowego, gdzie ich kontakt z człowiekiem jest bardzo prawdopodobny ze względu na turystyczny charakter regionu. Według danych Izby Turystyki Ministerstwa Gospodarki, w ciągu roku województwo warmińsko−mazurskie odwiedza 2,4 mln turystów, z czego prawie 1 mln w okresie wakacyjnym (2005 rok). Metoda zbioru kleszczy nie jest skomplikowana, ale też niełatwa. Niezbędne akcesoria, to wełniany kocyk o wymiarach około 1 na 0,5 m, pęsetka oraz probówka z alkoholem, do której będziemy wrzucać upolowane okazy. Oczywiście wymagany jest odpowiedni strój, który, ze względu na obecność innych krwiopijnych, latających i natrętnych stawonogów, powinien odkrywać jak najmniej. Przygotowani, możemy się udać do leśnych ostępów, najlepiej w godzinach największej aktywności kleszczy, tj. około godziny 900 oraz 1700. Kocyk, dodatkowo wyposażony w sznurek, ciągniemy za sobą, starając się omieść pobliską roślinność. Następny etap wymaga uzbrojenia się w cierpliwość – kocyk dokładnie oglądamy z obu stron w poszukiwaniu kleszczy. Łatwe? Nie bardzo, skoro larwa ma wielkość przysłowiowego łepka od szpilki.

Kolejny krok to badania laboratoryjne oparte na technikach biologii molekularnej. Kluczem do oznaczenia, czy kleszcz po ugryzieniu może nam przekazać pierwotniaka, jest DNA – kwas dezoksyrybonukleinowy, zbudowany z dwóch spiralnie zwiniętych nici. Każdą z nich tworzy ciąg nukleotydów zawierających zasady azotowe oznaczone jako A (adenina), G (guanina), C (cytozyna) i T (tymina), co stanowi genetyczny kod życia. Sekwencja nukleotydów tworzy niepowtarzalny zapis. Korzystając ze znajomości specyficznych sekwencji, można zidentyfikować określone organizmy.

Pierwszym etapem jest izolacja DNA z kleszczy. Obecność chitynowego pancerzyka nie ułatwia zadania, rozgniecenie go w małej probówce o nierównym dnie wymaga nie tylko siły, ale i zręczności. Następnie na pomoc przychodzą firmy biotechnologiczne z genialnie prostymi i gotowymi zestawami do izolacji ultraczystego DNA. Specjalnie przygotowane bufory i kolumny ze złożami wiążącymi odwracalnie DNA znacznie skracają czas izolacji. Efektem jest DNA w kilku kroplach buforu lub wody w szczelnie zamkniętej probówce.

Identyfikacja pasożyta

I co dalej? W jaki sposób przekonać się, czy w próbce, oprócz DNA kleszcza, znajduje się DNA pasożyta? Jak sprawdzić, czy kleszcz mógł nam przekazać patogeny? Niezastąpiony w takich przypadkach jest PCR, czyli reakcja łańcuchowej polimeryzacji. Jest to metoda powielania DNA, umożliwiająca uzyskanie milionów kopii sekwencji nukleotydów w ciągu kilku godzin poprzez serię zmian temperatury w jednym cyklu, powtarzanym około 30 razy. Kluczowym elementem w reakcji PCR jest zastosowanie krótkich sekwencji o długości 20−25 nukleotydów, zwanych starterami. Startery te rozpoznają specyficzną dla nich sekwencję w obrębie wyizolowanego DNA. Po przyłączeniu starterów rozpoczyna się kopiowanie określonego fragmentu DNA o znanej wielkości. Obecnie PCR jest metodą powszechnie stosowaną w klonowaniu DNA, sekwencjonowaniu, wprowadzaniu określonych mutacji, diagnostyce medycznej i medycynie sądowej. Prostotę i genialność tej metody doceniono w roku 1993, przyznając pomysłodawcy Kary’emu B. Mullisowi Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

Po przeprowadzeniu reakcji PCR pozostaje już tylko rozdzielić i uwidocznić namnożone DNA. W tym celu otrzymane po reakcji PCR próbki nanoszone są na żel agarozowy. Agaroza to naturalny polisacharyd wyizolowany ze ściany komórkowej krasnorostów, łatwo rozpuszczalny w wodzie, w temperaturze pokojowej tworzący żel. DNA ma ładunek ujemny nadawany przez obecne grupy fosforanowe, przez co migruje w polu elektrycznym w kierunku elektrody dodatniej. Szybkość migracji DNA w żelu zależy m.in. od wielkości cząsteczki. Aby uwidocznić rozdzielone prążki, żel moczy się w rakotwórczym roztworze bromku etydyny, który wbudowując się w dwuniciową strukturę DNA świeci w świetle UV w moim ulubionym, wrzosowym kolorze (zdjęcie 3, niestety czarno−białe).

Czy to już koniec? Nie, najciekawsze dopiero przed nami. Świecące prążki izolujemy z żelu, który z takim poświęceniem przygotowywaliśmy jeszcze parę godzin temu. DNA oczyszczamy, a następnie sekwencjonujemy, czyli poznajemy literka po literce kolejność nukleotydów. ATTCGCAACCGG... i tak do 1030, czyli długości, jaką ma nasze namnożone DNA. Korzystając z dobrodziejstw Internetu, naszą sekwencję porównujemy z sekwencjami zdeponowanymi w światowej bazie genów, co trwa kilka sekund bądź kilkadziesiąt minut, w zależności od szybkości naszego łącza. Jednak warto czekać. Nasza sekwencja jest taka sama, jak sekwencją genu Babesia microti, czyli kleszcz był zakażony.

Ale jeden kleszcz wiosny nie czyni. Musimy całą procedurę powtórzyć od początku kilkaset razy, aby oszacować odsetek zarażonych kleszczy, a tym samym ocenić ryzyko zachorowań wśród ludzi. Nudne? Na pewno nie. Pracochłonne? O, tak! Pozostaje już tylko analiza filogenetyczna, w celu ustalenia pokrewieństwa ewolucyjnego naszych mikropasożytów. Ale tym zajmie się już komputer.

Badania dotyczące wektorów odpowiedzialnych za przenoszenie patogenów to dopiero wierzchołek góry lodowej. Coraz częściej notuje się przypadki zachorowań ludzi powodowanych przez infekcje mieszane – kiedy kleszcz zaraża co najmniej dwoma rodzajami mikropasożytów. Nie mniej istotne jest oszacowanie odsetka zakażonych osobników zwierząt dzikich i domowych. Stanowią one grupę naturalnych żywicieli utrzymujących pasożyty w naszym najbliższym otoczeniu. Wreszcie zróżnicowanie genetyczne, pokrewieństwo filogenetyczne i pochodzenie patogennych szczepów mają niebywałe znaczenie w epidemiologii, diagnostyce, a w końcu w profilaktyce chorób odkleszczowych.

Zostawmy jednak skomplikowane badania. Pamiętajmy o tym, co najprostsze – zwykły środek przeciwkleszczowy, dostępny w aptece, może ocalić zdrowie, a nawet życie.